miR-183通过PI3K/AKT信号通路促进肾上腺嗜铬细胞瘤生长

张 炜，胡 志，付 桥，孙 伟，徐 律，褚 浩，王 潇，张景宇，张志超

(武汉市第三医院泌尿外科，武汉 430070；* 通讯作者,E-mail:vonbasten@163.com)

肾上腺嗜铬细胞瘤是一种起源于肾上腺髓质嗜铬细胞，具有代谢活性的神经内分泌肿瘤，约10%的肾上腺嗜铬细胞瘤细胞存在恶性行为，可转移至无嗜铬组织的部位[1,2]。嗜铬细胞瘤是一种罕见的肿瘤，世界范围内对该病的防治缺乏合理完善的方案，通常很难诊断和定位这些肿瘤[3]。恶性嗜铬细胞瘤的诊断只能在临床上有转移或局部浸润的情况下进行，因此，急需寻找出特异性生物标志基因来识别这种具有恶性潜能的肿瘤。微小核糖核酸(microRNAs，miRNAs)在多种癌症中起着癌基因或肿瘤抑制因子的关键性调控作用，可改善癌症预测、诊断、治疗及预后等过程，具有治疗靶点和生物标志物的潜在价值[4,5]。全基因组微阵列分析发现有8个miRNAs在良性和恶性嗜铬细胞瘤之间存在显著差异表达，其中miR-483-5p、miR-183和miR-101在恶性嗜铬细胞瘤肿瘤样本中异常高表达，可作为鉴别良性和恶性嗜铬细胞瘤的诊断标志物[6]。研究表明，嗜铬细胞瘤中miR-183家族成员(包括miR-96/182/183)与临床参数和琥珀酸脱氢酶基因B亚单位(succinate dehydrogenase enzyme subunit B，SDHB)蛋白的表达有关[7]。PI3K/AKT信号通路是调控肿瘤生长和转移的关键通路，有研究表明，该通路的激活可显著抑制肿瘤细胞凋亡[8]。因此，本研究通过上调或下调miR-183的表达，观察其对肾上腺嗜铬细胞瘤PC-12细胞的影响，及其对PI3K/AKT信号通路的作用，探讨miR-183在肾上腺嗜铬细胞瘤中可能的分子机制，以期为肾上腺嗜铬细胞细胞瘤的临床诊断和治疗奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 细胞转染

1.3 RT-PCR检测转染效率

转染24 h后，采用RT-PCR检测各组PC-12细胞中miR-183的表达变化。Trizol提取细胞总RNA，反转录合成cDNA。以cDNA为模板进行RT-PCR扩增，PCR引物由武汉天一辉远生物科技有限公司合成，引物序列如下：miRNA-183-5p-F：5′-GGGTATGGCACTGGTAG-3′，miRNA-183-5p-R：5′-AACTGGTGTCGTGGAGTCGGC-3′；U6-F：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，U6-R：5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。

1.4 CCK-8检测细胞活力

将转染后的细胞接种于96孔板中，5×103个/孔，每孔180 μl，培养过夜。分别于转染后24，48，72 h取出细胞培养板，每孔加入10 μl CCK-8溶液，继续培养4 h。酶标仪检测450 nm处各孔的吸光值，绘制各组细胞生长曲线。

1.5 流式细胞术检测细胞周期

将培养好的不同组细胞用0.25%胰酶消化制备成单细胞悬液，并收集约5×104个重悬细胞至流式专用管中。1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入300 μl含10%胎牛血清的PBS溶液重悬细胞，再加入700 μl无水乙醇于-20 ℃中固定24 h。3 000 r/min离心30 s，弃上清，PBS洗涤2次。加入400 μl碘化丙啶(PI)溶液(50 μg/ml)，避光染核10 min，流式细胞仪测定DNA含量。统计各组G1期细胞比例。

1.6 流式细胞术检测细胞凋亡

取约5×104个重悬细胞，1 000 r/min离心5 min，弃上清，PBS洗涤3次。1 000 r/min离心5 min，加入200 μl binding buffer重悬细胞，加入10 μl Annexin Ⅵ-FITC和10 μl PI，混匀，4 ℃避光孵育30 min，加入300 μl binding buffer，进行流式细胞仪检测。

1.7 划痕实验观察细胞迁移能力

将转染24 h后的各组细胞接种于6孔板中，约1×106个/孔，培养过夜。用无菌枪头划痕，加入无血清培养基继续培养。分别于0 h和24 h拍照对比，观察细胞的迁移情况。

1.8 Transwell小室检测细胞侵袭能力

实验前24 h对细胞进行血清饥饿处理，胰酶消化细胞，用无血清培养基洗涤细胞。取0.5 ml细胞(1×105个/ml)悬液接种于Transwell小室中，下层24孔板中加入0.75 ml含10%胎牛血清的培养基，继续培养24 h。每孔加入1 ml 4%甲醛固定10 min，吸去固定液，加入1 ml 0.5%结晶紫溶液，室温染色30 min。PBS洗涤3次，晾干后于显微镜下观察，随机选取3个视野的侵袭细胞计数并拍照。

1.9 Western blot检测Cyclin E1、Bax、PI3K和AKT蛋白表达

提取转染24 h后的细胞总蛋白，蛋白定量后经过SDS-PAGE电泳分离，再将蛋白转印至PVDF膜上，室温封闭2 h。加入一抗稀释液(Cyclin E1、Bax、PI3K、AKT、GAPDH，稀释比均1∶1 000)，室温孵育1 h。PBS洗涤3次，加入二抗稀释液(HRP标记的IgG)，室温孵育1 h。PBS洗涤3次，加入化学发光试剂，全自动化学发光分析仪检测。

1.10 统计学分析

2 结果

2.1 转染效率检测

RT-PCR检测各组细胞miR-183表达水平。与NC-mimic组比较，miR-183-mimic组miR-183表达升高，差异有统计学意义(P<0.01)；与NC-inhibitor组比较，miR-183-inhibitor组miR-183表达降低，差异有统计学意义(P<0.01)；对照组、NC-mimic组和NC-inhibitor组之间无显著差异(P>0.05，见图1)。说明本次研究转染实验成功，可进行后续检测。

与NC-mimic组比较，* * P <0.01；与NC-inhibitor组比较，## P <0.01

2.2 miR-183对PC-12细胞增殖的影响

培养72 h，与NC-mimic组比较，miR-183-mimic组细胞活力增强(P<0.01)；与NC-inhibitor组比较，miR-183-inhibitor组细胞活力减弱(P<0.01)；对照组、NC-mimic组和NC-inhibitor组之间无显著差异(P>0.05，见图2)。表明过表达miR-183可促进PC-12细胞增殖。

与NC-mimic组比较，* * P <0.01；与NC-inhibitor组比较，## P <0.01

2.3 miR-183对PC-12细胞周期的影响

周期检测结果显示，与NC-mimic组比较，miR-183-mimic组细胞G1期细胞比例降低(P<0.01)；与NC-inhibitor组比较，miR-183-inhibitor组G1期细胞比例升高(P<0.01)；对照组、NC-mimic组和NC-inhibitor组G1期细胞比例之间无显著差异(P>0.05，见图3)。

与NC-mimic组比较，* * P <0.01；与NC-inhibitor组比较，## P <0.01

2.4 miR-183对PC-12细胞凋亡的影响

各组细胞早期凋亡水平之间无明显差异(P>0.05)。与NC-mimic组比较，miR-183-mimic组细胞晚期凋亡率降低(P<0.05)；与NC-inhibitor组比较，miR-183-inhibitor组细胞晚期凋亡率升高(P<0.01)；对照组、NC-mimic组和NC-inhibitor组细胞晚期凋亡率之间无显著差异(P>0.05，见图4)。表明过表达miR-183抑制PC-12细胞凋亡。

与NC-mimic组比较，* * P <0.01；与NC-inhibitor组比较，## P <0.01

2.5 miR-183对PC-12细胞形态及迁移的影响

miR-183-inhibitor组细胞出现固缩，细胞相对弥散，细胞生长状态异常，而其他组细胞长出类似交感神经元样的突起，有多细胞聚集体；miR-183-mimic组迁移的细胞增多，划痕间隔距离最短(见图5)。

2.6 miR-183对PC-12细胞侵袭的影响

与NC-mimic组比较，miR-183-mimic组侵袭细胞数量增多(P<0.01)；与NC-inhibitor组比较，miR-183-inhibitor组侵袭细胞数量减少(P<0.01)；对照组、NC-mimic组和NC-inhibitor组侵袭细胞数之间无显著差异(P>0.05，见图6)。表明过表达miR-183可促进PC-12细胞侵袭。

2.7 miR-183对PC-12细胞周期及凋亡相关蛋白表达的影响

与NC-mimic组比较，miR-183-mimic组细胞内Cyclin E1蛋白相对表达量升高(P<0.01)，Bax蛋白表达量降低(P<0.01)；与NC-inhibitor组比较，miR-183-inhibitor组Cyclin E1蛋白表达量降低(P<0.05)，Bax蛋白表达量升高(P<0.01，见图7)。对照组、NC-mimic组和NC-inhibitor组细胞内Cyclin E1和Bax蛋白相对表达量无显著差异(P>0.05)。

与NC-mimic组比较，* * P <0.01；与NC-inhibitor组比较，## P <0.01

2.8 miR-183对PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达的影响

与NC-mimic组比较，miR-183-mimic组细胞内PI3K和AKT蛋白相对表达量升高(P<0.01)；与NC-inhibitor组比较，miR-183-inhibitor组PI3K和AKT蛋白相对表达量降低(P<0.05)；对照组、NC-mimic组和NC-inhibitor组细胞内PI3K和AKT蛋白相对表达量无显著差异(P>0.05，见图8)。

与NC-mimic组比较，* * P <0.01；与NC-inhibitor组比较，## P <0.01

3 讨论

肾上腺嗜铬细胞瘤是罕见的神经内分泌肿瘤，临床表现多种多样，早期诊断和治疗具有挑战性[9]。肿瘤的发生和发展是多步骤进行、多因素影响的复杂过程，miRNAs可通过与靶基因的3′非编码区(3′-UTR)结合，导致胞质降解和靶基因翻译抑制，进而参与了肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭等生物学行为，影响肿瘤的发生发展[10,11]。因此，肿瘤组织中miRNAs转录后调控机制成为医学领域的热门话题之一。miR-183在肿瘤中发挥抑癌基因还是癌基因的作用，一直以来存在争议。研究发现miR-183在鼻咽癌组织和细胞中表达下调，过表达miR-183可抑制肿瘤的生长，并增强顺铂诱导的细胞毒性[12]。临床数据显示miR-183在子宫内膜癌组织中的表达水平显著低于癌旁组织，抑制miR-183表达，肿瘤细胞的凋亡率显著降低[13]。而miR-183在人肺腺癌和鳞状细胞癌标本均呈现高表达，有助于肿瘤细胞的免疫逃避[14]，Kang等[15]研究发现miR-183过表达可促进肺部肿瘤的发生和疾病侵袭性。miR-183在结肠癌、前列腺癌等疾病中也发挥着癌基因的作用，参与了疾病的转移和侵袭[16,17]。由此说明，miR-183在不同的疾病中发挥着不同的作用。基于miR-183在恶性嗜铬细胞瘤中异常高表达[6]，本研究进一步探讨了miR-183对嗜铬细胞瘤PC-12细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响及机制，旨在为肾上腺嗜铬细胞瘤的临床治疗提供实验基础。

本研究通过转染mimic和inhibitor改变PC-12细胞中miR-183的表达，结果显示，过表达miR-183可促进肾上腺嗜铬细胞瘤PC-12细胞增殖、迁移和侵袭，抑制细胞凋亡，反之，抑制miR-183表达后，细胞发生G1期阻滞，增殖、迁移和侵袭能力减弱，晚期凋亡率升高，提示miR-183在肾上腺嗜铬细胞瘤中发挥癌基因作用。因此，本研究进一步探索了miR-183调控PC-12细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的机制。

PI3K/AKT信号通路在许多肿瘤发生过程中被异常激活，在肿瘤的发生发展中起关键作用，此外，其还参与调节癌细胞存活、增殖、侵袭和迁移等多种生物学过程，抑制该途径已成为癌症治疗中的热门研究课题[18]。Xu等[19]研究发现HSP70抑制剂VER155008通过抑制PI3K/AKT/mTOR和MEK/ERK信号通路抑制PC-12细胞增殖和迁移，并促进细胞凋亡。细胞从一个周期阶段进入下一个阶段的过程受到细胞周期蛋白及其催化亚单位的调节，细胞周期蛋白依赖性激酶(Cdk)便是细胞周期间过渡的驱动因子[20]。Cyclin E1是Cdk2的调节亚单位，当其表达下调时，细胞G1/S周期转换受到抑制[21,22]。Bax是Bcl-2家族中促凋亡蛋白之一，参与了线粒体控制的内源性凋亡途径，当Bax接收到凋亡信号后向线粒体转移，改变线粒体膜通透性，促进细胞色素c(Cyt-c)的释放，引发下游级联反应，导致细胞发生凋亡[23,24]。本研究发现，miR-183可调控细胞周期及凋亡相关蛋白Cyclin E1和Bax表达，进一步本研究探索了miR-183对PI3K/AKT信号通路的影响，结果发现，过表达miR-183的PC-12细胞中PI3K和AKT蛋白表达水平显著升高，而抑制miR-183后，PI3K和AKT蛋白表达水平降低，表明miR-183对PC-12细胞的影响与PI3K/AKT信号通路有关。

综上所述，miR-183促进肾上腺嗜铬细胞瘤细胞增殖、迁移和侵袭，抑制细胞凋亡，发挥癌基因的作用，其作用机制可能与调控PI3K/AKT信号通路有关，可作为肾上腺嗜铬细胞瘤的治疗靶点。后续实验我们将进一步对miR-183在嗜铬细胞瘤中的靶基因进行深入研究。