亚铁强化人工湿地去除磺胺类抗生素抗性基因

2022-09-24林子博刘向群

节水灌溉 2022年9期

袁涛，程森，林子博，王瑞，刘向群，路平

（1.中国矿业大学力学与土木工程学院，江苏徐州 221000；2.江苏建筑职业技术学院建筑装饰学院，江苏徐州 221000；3.江苏建筑节能与建造技术协同创新中心，江苏徐州 221000；4.中国矿业大学环境与测绘学院，江苏徐州 221116；5.中国矿业大学附属医院，江苏徐州 221799）

0 引言

磺胺类抗生素是水产养殖行业常用的抗生素，可治疗由微生物引起的疾病。磺胺类抗生素难以被生物完全吸收，多数会通过粪尿被排出体外[1,2]，这使得其在各类天然水体中检出频率较高[3,4]。残留的抗生素会诱导微生物产生耐药性，加剧环境中抗生素抗性基因（Antibiotic resistance genes，ARGs）的污染[5,6]。ARGs 污染问题已经引起全球范围的高度重视[7,8]，特别是在水产养殖行业中抗生素滥用的现象严重，如果允许未经处理或处理不当的养殖废水排入环境，将对人体健康构成威胁。

全球多地开展了水产养殖区域ARGs 的污染调查，研究表明：水产养殖区各类ARGs丰度显著高于非养殖区，其中磺胺类ARGs 的检出率和相对丰度均较高[9,10]，例如芬兰波罗海区域养殖场[11]、智利淡水鳟鱼养殖区[12]、日本海水养殖区[13]、越南淡水产养殖区[14]、我国海南、广东、天津、杭州、烟台、太湖等地[15-17]。

传统的污水处理技术对ARGs 的去除并不完全，出水中仍残留大量ARGs[18,19]，亟需开展养殖废水中ARGs的去除技术研究。但是相关研究十分有限。2013年曾报道了人工湿地去除ARGs 的可能性[20]，后又有研究发现水平潜流湿地对ARGs 的去除效率高于垂直潜流湿地，特别是对磺胺类ARGs[21,22]。

Fe2+可提高人工湿地的去除效率，例如：硫酸亚铁可以提高垂直潜流湿地对硝酸盐的去除率[23]。在硫酸亚铁对人工湿地处理水产养殖废水的影响研究中发现，当亚铁离子添加量为20 mg/L 时，总氮（TN）、总磷（TP）、化学需氧量（COD）去除率达95%±1.9%、77%±1.2%、62%±2%[24]。同样，在污泥硝化过程中添加氯化亚铁可提高33.3%的ARGs 去除效果[25]。不过也有研究表明，Fe2+虽然促进了污水污泥中胞内ARGs 的去除，但也会增加污水污泥中胞外ARGs 的丰度[26]。由此可见，Fe2+对ARGs 的去除作用尚不明确，人工湿地中Fe2+对ARGs 的去除效果也尚不清楚。

因此，本研究针对水产养殖废水中ARGs 污染问题，采集了渔业养殖废水作为处理原水，构建了以沸石为主要填料的水平潜流人工湿地，以磺胺类抗生素的抗性c 基因sul1 和sul2及16S rRNA 为研究对象，通过荧光定量PCR 测定基因丰度，探讨Fe2+对sul1，sul2 和16S rRNA 的去除作用和机制，以期为水产养殖废水处理提供科学参考。

1 实验材料与方法

1.1 实验装置

在实验室进行水平潜流人工湿地实验模拟，构建四个湿地（长60 cm、宽40 cm、高40 cm）。装置中部为湿地主填料区，长50 cm，两端分别为进水区和出水区，长为5 cm。人工湿地中部填充粒径为4～8 mm 的沸石，填充高度为30 cm，有效容积约30 L。在人工湿地装置前后端的进水区与出水区，填入粒径为10～20 mm 的砾石，填充高度为30 cm。进水区，出水区与中部填料区间设有隔板。为了促进布水均匀，在进水区上部与出水区底部的隔板上设有一排直径5 mm 小孔。出水口设置在出水区上部。

1.2 实验运行与样品采集

实验运行进水采用徐州市北郊采煤塌陷地渔业复垦塌陷地中的鱼塘原水，原水样品采集于2020年秋季。4种人工湿地进水中四水合氯化亚铁添加量分别为0 mg/L（CW1）、20 mg/L（CW2）、40 mg/L（CW3）、80 mg/L（CW4）。人工湿地的进水水质情况如表1所示。一次配制60L 进水样贮存于塑料桶中，为确保进水水质不变，每隔5 d 重新配制进水。采用连续进水方式，设置水力停留时间为3 d，流量约为10 L/d（BT601L 型蠕动泵），以湿地形成稳定的出水时开始计时，分别采集5、10、20、30 d的进水和出水水样，每组实验运行30 d。

表1 人工湿地进水水质Tab.1 Contents of conventional pollutants in the influent

1.3 样品测试

对进水和出水水样中常规污染物（pH、COD、TN、氨氮NH4-N、TP、总铁）和基因（sul1、sul2 和16S rRNA）进行检测，并进行微生物多样性测试。

（1）常规污染物测定。样品pH 值采用PXSJ-216F 型pH计测定，COD和NH4-N采用5B-3B(V8)型多参数水质测定仪测定，TP 采用钼酸铵分光光度法测定，TN 采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法测定，总铁采用邻菲罗啉分光光度法测定。

（2）ARGs与16S rRNA基因丰度测定。基因与微生物多样性检测所用水样经0.22 μm 滤膜抽滤（SHZ-D(Ⅲ)型真空抽滤泵）后，滤膜置于灭菌离心管中，于-80 ℃下超低温冷冻贮藏，送至上海美吉生物科技有限公司进行测序。利用FastDNA® Spin Kit for Soil (MP Biomedicals,CA,USA)试剂盒提取样品基因组DNA。采用1%琼脂凝胶电泳（dyy-6c型双稳定时电泳仪）检测DNA 样品的质量和完整性。磺胺类ARGs（sul1 和sul2）和16S rRNA 采用荧光定量PCR（ABI7300 型，Applied Biosystems，美国）测定其绝对丰度，基因测序引物如表2所示。

表2 基因测序引物Tab.2 Gene sequencing primers

（3）微生物多样性测定。为探究氯化亚铁添加量对湿地进水和出水微生物群落结构的影响及ARGs去除机制，选取实验运行5 d 的初始进水作为湿地进水样品（CW1、CW2、CW3、CW4 进水微生物多样性测试样品分别命名为A1、B1、C1、D1），运行30 d 的最终出水作为湿地出水样品（CW1、CW2、CW3、CW4 出水微生物多样性测试样品分别命名为A2、B2、C2、D2），共8 个样品进行微生物多样性检测。PCR扩增引物采用V3-V4 区通用引物（338F/806R），引物序列分别为338F （ACTCCTACGGGAGGCAGCAG）和 806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）。

每个样本进行3 次重复，取混合后的PCR 产物，用2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA 凝胶回收试剂盒切胶回收PCR 产物，用Tris_HCl 洗脱，并用2%琼脂糖电泳检测。将PCR 产物用QuantiFluor™-ST 蓝色荧光定量系统进行检测定量，使用Illumina MiSep 平台进行测序。提取非重复序列，降低分析中间过程冗余计算量，去除没有重复的单序列。按照97%相似性对非重复序列（不含单序列）进行OTU 聚类，去除嵌合体，获得OTU 代表序列。将优化序列map至OTU 代表序列，选出与OTU 代表序列相似性在97%以上的序列，生成OTU 表格。用RDP classifier 贝叶斯算法对97%相似水平的OTU 代表序列进行分类学分析，统计各样本的群落物种组成。

2 实验结果

2.1 基因去除效果

测算出CW1、CW2、CW3 和CW4 在不同运行时间中出水sul1、sul2与16S rRNA与实验进水中相应值的差值，再除以实验进水中的相应值，即可得到该人工湿地对基因的去除率。实验结果表明，向原水中添加氯化亚铁，能够提高ARGs的去除效率。如图1所示，实验运行5 d时，4种湿地实验对sul1的去除率较低。CW1 对sul1 的去除率仅有5.99%，添加亚铁后，CW2、CW3 和CW4 对sul1 的去除率分别达到24.94%、48.49%、69.99%。运行10 d后，4种实验条件下sul1的去除率出现较为明显的增加，CW2，CW3 和CW4 对sul1 的去除率分别由CW1 的78.66%提升至85.77%、92.78%和94.53%。其后的20 d和30 d，sul1的去除效率变化不大，趋于稳定。在整个运行期间内，CW1，CW2，CW3 和CW4 对sul1 的平均去除率分别为60.62%、76.07%、82.79%和88.57%，sul1 的去除率随着氯化亚铁添加量的增加而提高。然而sul2 和16S rRNA 去除率并非随着浓度提高而提高。对于sul2，当氯化亚铁添加量为0 mg/L 或20 mg/L 时，最佳去除率出现在运行20 d 时，分别为95.79%和98.25%；当氯化亚铁添加量为40 mg/L 或80 mg/L时，最佳去除率出现在运行30 d 时，分别为95.31% 和96.94%。对于16S rRNA，当氯化亚铁添加量为0 mg/L 或20 mg/L 时，最佳去除率出现在运行20 d 时，分别为92.41%和95.74%；当氯化亚铁添加量为40 mg/L 或80 mg/L 时，最佳去除率出现在运行30 d时，分别为95.88%和95.53%。

图1 基因去除率随时间变化情况Fig.1 Changes of genes removal rate over time

添加氯化亚铁，改变了进水和出水中基因的绝对丰度。如图2所示，进水中sul1 的绝对丰度高于sul2，添加亚铁后，进水中sul1 和sul2 的绝对丰度都有升高。但相比sul1 和sul2，16S rRNA 的绝对丰度变化情况有所不同。CW3 和CW4 进水中16S rRNA 的绝对丰度有所降低。出水的变化情况表明：CW2、CW3 和CW4 中sul1 的出水绝对丰度均低于CW1，尤其是CW3和CW4，出水中sul1 的绝对丰度比CW1 降低了50%以上。然而，CW2、CW3 和CW4 出水中sul2 的绝对丰度均高于CW1，表明添加亚铁后，实验出水中sul2 绝对丰度升高，但随着氯化亚铁添加量的增加，出水sul2 绝对丰度逐渐降低，这与出水中16S rRNA 绝对丰度的变化趋势相似。因此，综合考虑添加氯化亚铁，对人工湿地对基因的去除效率和绝对丰度变化，当氯化亚铁添加量为80 mg/L 时，人工湿地实验槽对sul1 和sul2的去除效果最优。

图2 实验进水和出水中基因绝对丰度变化情况Fig.2 Changes in the absolute abundance of genes in the influent and effluent

为避免测试误差，对湿地进水和出水ARGs 的相对丰度进行了比较（ARGs的相对丰度为sul1或sul2与16S rRNA 的绝对丰度的比值）。研究发现，sul1 和sul2 相对丰度的变化趋势与其绝对丰度基本一致。如图3所示，CW2、CW3 和CW4 出水中sul1 的相对丰度均低于CW1；而sul2 在湿地进水和出水中的相对丰度随着亚铁添加量的增加而增加。

图3 实验进水和出水中基因相对丰度变化情况Fig.3 Changes in the relative abundance of genes in the influent and effluent

2.2 水质变化特征

添加氯化亚铁加强了人工湿地对常规污染物的去除效果。实验出水水质如表3所示，与最初的原水进行比较，各类污染物指标均达到排放要求，CW1 和CW2 出水TP 满足二级排放要求，CW3 和CW4 出水TP 满足一级排放要求，CW2、CW3 和CW4 出水TN 满足一级排放要求。出水pH 值升高，COD、TP、TN 和NH4-N 的质量浓度降低。

表3 实验出水水质Tab.3 Concentration of conventional pollutants in the effluent

CW1、CW2、CW3 和CW4 出水pH 值无显著差异（P＞0.05）。实验运行期间TP、COD、TN 和NH4-N 的去除率如图4所示。未添加亚铁的湿地实验中，COD、TP、TN 和NH4-N 的平均去除率分别为42.92%、54.19%、59.01%和63.75%。添加不同剂量的亚铁后，人工湿地对COD 的去除效果有小幅度提升，CW2、CW3 和CW4 对COD 的平均去除率分别为46.73%、50.78%和49.48%。人工湿地对TP、TN 和NH4-N 的去除率有明显提高。CW2、CW3 和CW4 对进水TP、TN 和NH4-N 的去除率明显提高至70.93%、75.71%和76.83%。且随着亚铁添加量的增加，TP 的去除率逐渐增加。CW2、CW3 和CW4 对TN的平均去除率分别提高至78.03%、75.69%和76.42%，CW2对TN的去除率最高。CW2、CW3和CW4对NH4-N的平均去除率分别提高至64.85%、69.44%和70.14%。然而，运行至20d后，CW4 对NH4-N 的去除率降低，CW3 对NH4-N 去除率最高，说明较高的氯化亚铁投加量降低了NH4-N 的去除效果。CW1 对NH4-N 的去除率高于TN，而CW2、CW3 和CW4 对TN 的去除率高于NH4-N，说明亚铁对TN 的去除效果提升更明显。综上，CW2、CW3 和CW4 对原水TP、TN 和NH4-N 的去除效果提升明显。氯化亚铁添加量为40 mg/L 和80 mg/L 时，TP、COD 和NH4-N 的去除率相近且较高；氯化亚铁添加量为20 mg/L时，TN的去除率略高。

图4 常规污染物去除率随时间变化情况Fig.4 Changes in the removal rate of conventional pollutants over time

实验出水中总铁的质量浓度如图5所示。在运行期间内，出水总铁的质量浓度均小于1 mg/L。CW1、CW2 和CW3 出水总铁的质量浓度逐渐降低，而CW4 出水总铁的质量浓度先降低后逐渐升高。综合考虑污染物去除效果和出水总铁的质量浓度，氯化亚铁添加量为40 mg/L 时，对常规污染物去除效果较好。

图5 实验出水总铁含量Fig.5 Total iron concentration in the effluent

2.3 微生物群落结构变化特征

实验进水和出水微生物多样性指数如表4所示。在进水中，由Shannon 指数和Simpson 指数可知，添加氯化亚铁后增加了进水中微生物多样性，而随着氯化亚铁添加量的增加，进水微生物多样性降低。Ace指数和Chao 1指数逐渐增加，表明细菌丰富度随着氯化亚铁添加量的增加而增加。在出水中，添加氯化亚铁同样增加了出水的微生物多样性。而添加少量氯化亚铁增加了出水的细菌丰富度，加大氯化亚铁添加量，出水的细菌丰富度降低。

表4 进水和出水微生物多样性指数表Tab.4 Microbial diversity index of influent and effluent

如图6所示，实验进水中放线菌门（Actinobacteria）最为优势，在CW1、CW2、CW3 和CW4 中分别占比25.37%、38.82%、38.83% 和34.21%，其次较为优势的有变形菌门（Proteobacteria）、异性拟杆菌门（Bacteroidota）、Patescibacteria 和蓝细菌门（Cyanobacteria）等。添加氯化亚铁后，放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、蓝细菌门（Cyanobacteria）、Planctomycetota 和疣微菌门（Verrucomicrobiota）等相对丰度增加，Patescibacteria、厚壁菌门（Firmicutes）和脱硫细菌门（Desulfobacterota）等相对丰度减小。在细菌属水平上，Norank_O_Saccharimonadales 在CW1进水中相对丰度最高，占比21.48%。而CW2、CW3和CW4中HgcI_clade 相对丰度最高，分别占比12.80%、8.40% 和12.19%。其次，相对丰度较高的有CL500-29_marine_group、Norank_F_67-14、分枝杆菌属（Mycobacterium）等。添加氯化亚铁后，进水中Norank_O_Saccharimonadales 相对丰度大幅降低，而HgcI_clade相对丰度增加。

图6 实验进水细菌组成Fig.6 Bacteria composition of influent

如图7所示，实验出水中变形菌门（Proteobacteria）最为优势，随着氯化亚铁添加量的增加，变形菌门（Proteobacteria）占比逐渐增加。其次较为优势的有放线菌门（Actinobacteria）、异性拟杆菌门（Bacteroidota）、Patescibacteria 和蓝细菌门（Cyanobacteria）等。在属水平上，分枝杆菌属（Mycobacterium）、Methylotenera、Norank_F_67-14、嗜甲基菌属（Methylophilus）和 Norank_O_Vampirovibrionales等相对丰度较高。由此可见，添加氯化亚铁改变了进出水中微生物群落的结构，降低了实验出水中分枝杆菌属（Mycobacterium）的相对丰度。CW1、CW2、CW3 和CW4 出水中分枝杆菌属（Mycobacterium）的占比分别为19.04%、10.86%、13.12%和4.80%。Methylotenera 和嗜甲基菌属（Methylophilus）相对丰度随着氯化亚铁添加量的增加呈现升高的趋势。

图7 实验出水细菌组成Fig.7 Bacteria composition of effluent

3 分析与讨论

分别将进水和出水sul1、sul2 绝对丰度与pH、总铁、COD、TP、TN 和NH4-N 的质量浓度进行冗余分析（RDA），结果如图8所示。进水和出水中sul1 和sul2 均与常规污染物相关性较低，而与16S rRNA 相关性较高。进水16S rRNA 对sul1和sul2 的解释度为49.3%，具有显著影响（P＜0.05）；出水16S rRNA 对sul1 和sul2 的解释度为59.1%，影响显著。此外，出水总铁的质量浓度对sul1 和sul2 的解释度为33.9%，也具有一定影响。先前研究同样表明sul1、sul2 与16S rRNA 显著正相关[27,28]。ARGs 与COD、TP 和TN 等污染物间的相关性较弱，这说明Fe2+在去除ARGs 中发挥了不同于常规污染物的作用，需要从微生物水平进一步探究其去除机制。

图8 进水和出水ARGs绝对丰度RDA分析Fig.8 RDA analysis of absolute abundance of ARGs in influent and effluent

3.1 亚铁促进了基因转移作用

ARGs 在环境中可进行水平转移和垂直转移。垂直基因转移是在亲代和子代间的转移。嗜甲基菌属（Methylophilus）为多重耐药细菌[29]，军团菌属（Legionella）是ARGs 潜在宿主[30]。添加氯化亚铁后，出水中嗜甲基菌属（Methylophilus）和军团菌属（Legionella）的相对丰度增加，可通过垂直转移增加ARGs 的丰度。水平转移是ARGs 在环境中传播的重要途径。质粒作为重要的可移动遗传元件，在没有过量诱导剂的条件下也可以高效转移到新宿主中[31]，这一机制对磺胺类ARGs（sul1 和sul2）的传播具有重要作用[32]。整合子与ARGs间存在正相关，对ARGs 的传播同样具有重要作用[33]。人工湿地对两种磺胺类ARGs（sul1 和sul2）的去除效果存在差异，或是由于基因本身特质的不同[34]。基因sul1 通常与1 类整合子中其他ARGs 相关联，而sul2 通常位于小的非结合质粒上或大型可传播的多重抗性质粒[35,36]。添加氯化亚铁后，水体pH 值降低，对ARGs 的水平转移具有促进作用[37]。铁的絮凝作用使微生物细胞间接触更紧密，并增加胞外ARGs与微生物细胞的接触，从而促进ARGs 的水平转移[38]，进而增加进水ARGs 的相对丰度。

3.2 亚铁促进了基质过滤作用

基质吸附和微生物去除是人工湿地去除ARGs 的主要机制，而基质吸附对ARGs 的去除作用较小，ARGs 与微生物关系密切，湿地对ARGs的去除主要依靠基质对微生物的过滤作用[39,40]。在运行初期，sul1、sul2 和16S rRNA 的去除率较低，或是因为运行初期人工湿地对微生物的过滤效果较低，随着运行时间的增加，水体中的悬浮物和微生物等减小了基质间的间隙，从而提升了去除效果。水平潜流湿地对携带sul1 的细菌具有较好的去除效果[41]，分枝杆菌属（Mycobacterium）是ARGs 的潜在宿主[30]。添加氯化亚铁后，分枝杆菌属（Mycobacterium）在出水中的相对丰度降低，且添加量较多时出水微生物丰富度降低，说明添加氯化亚铁增加了湿地对sul1宿主细菌的过滤效果或抑制其生长繁殖，使得出水sul1 绝对丰度随添加量增加而降低，并使出水sul1 的相对丰度低于进水。ARGs 可分为胞内ARGs 和胞外ARGs，胞外ARGs 丰度较高[42]，可吸附于土壤或沉积物颗粒上，以延长在环境中的持久性[43]。添加氯化亚铁后，增加了水体中悬浮物和胶体的质量浓度，悬浮物和胶体颗粒吸附胞外ARGs使其无法穿过滤膜，进而增加了进水中sul2 的相对丰度和绝对丰度。经人工湿地处理后，大部分悬浮物被过滤，增加了ARGs的去除率。