海南文昌鸡源抑菌乳酸菌的筛选鉴定

陈泽世，白国松，边拯宇，李连彬

（海南大学 动物科技学院，海口 570228）

肉鸡养殖业在我国畜牧业中扮演重要角色，尤其是海南省的肉鸡规模效率达到1，明显优于其他省份[1]。文昌鸡作为海南省特色畜禽品种，在当地畜禽养殖业中起到支撑作用，但在其养殖过程中极易受到肠道疾病的困扰，如大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌等引发的疫病或菌落失调症等。治疗此类疾病往往只有抗生素疗法，但抗生素的大量使用，增强了细菌的耐药性和相关产品的药物残留，严重危害动物和人体健康，因此，人们迫切需要寻找到新的产品来替代抗生素[2]；此外，饲料抗生素添加剂于2020年开始被全面禁止[3]。可见，饲料中添加抗生素替代品的需求进一步加大。

在抗生素替代品的选择中，乳酸菌具有较大的优势。乳酸菌具有调节肠道菌群平衡、抑制肠道病菌、利于营养物质的消化吸收、提高机体免疫系统能力等作用，同时其具有生长快、产酸量高等特点[4]；乳酸菌作为微生态饲料添加剂在畜牧业中的使用越来越广泛，是抗生素的理想替代品[5]。

近年来，国内外对优良乳酸菌菌株的筛选及益生特性的研究比较活跃[6-7]，但是对热带动物肠道源乳酸菌的筛选研究较少。海南省拥有独特的热带季风和海洋气候，炎热潮湿的气候利于细菌的滋生[8]，加之环境的不同也会影响益生菌的生存以及功能的发挥[9-10]。因此，本试验针对热带地区的家禽养殖业，以海南文昌鸡肠道内容物为样品，从中分离筛选优质热带动物肠道源抑菌乳酸菌，为微生态制剂替代抗生素提供更广泛的原料来源和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品来源试验用海南文昌鸡4只经处死后，采集肠道粘膜及内容物，分别放于不同编号的10 mL 试管内，4 ℃ 保存备用。

1.1.2 培养基及主要试剂MRS 琼脂培养基、MRS肉汤培养基和LB肉汤培养基均购自青岛海博生物技术有限公司。细菌基因组提取试剂盒购自北京全式金生物有限公司。Golden Star T6 Super PCR Mix (1.1×) 购自北京擎科生物科技有限公司。

1.1.3 标准菌株菌株均由本实验室提供，信息如表1所示，标准菌株于-80 ℃低温保存，保存完好，未被污染。

表 1 标准菌株信息

1.1.4 主要仪器电子天平（PA2004C，上海佑科仪器仪表有限公司）；立式压力蒸汽灭菌器（YXQ.L-75，鸡西市辰丰医疗器械制造有限公司）；恒温培养摇床（FS-70B，黄骅菲斯福实验仪器有限公司）；微波炉（20MX34-L，中山东菱威力电器有限公司）；冰箱（BCD-218STPS，海尔智家股份有限公司）；电热鼓风干燥箱（WGL-230B，黄骅菲斯福实验仪器有限公司）；超净工作台（SW-CJ-2F，苏州净化设备有限公司）；医用低温箱（MDF-U5386S，松下健康医疗器械有限公司）等。

1.1.5 细菌基因组提取按照试剂盒说明书提取菌株的DNA，保存于-20 ℃备用。

1.1.6 引物序列扩增菌株 16S rRNA 基因序列所用的引物如表2所示。

表 2 16S rRNA 基因序列测序所用引物序列

1.2 菌株的分离纯化及保种取 1 g 肠道内容物，溶入到生理盐水中，摇匀，以10倍为梯度，逐渐稀释到10-5，取最后2～3个稀释梯度的液体20 μL，利用涂布棒涂到已加入 2% CaCO3的MRS固体培养基上，利用封口膜封口，37 ℃下放置2 d。挑选形态较好且产生钙圈的单菌落置于MRS肉汤培养基中，继续培养16～24 h，将菌液接种到平板上培养2 d，即完成1次纯化。纯化3次之后，获得形态较为一致的菌落。取已培养16～24 h的菌液与50%的灭菌丙三醇等量，加入到2 mL小离心管中进行混合，设置3个重复，做好标记，放超低温冰箱内备用。

1.3 分离菌的鉴定筛选

1.3.1 形态学特征观察分离的菌株，挑选在培养基上产生溶钙圈且呈乳白色、凸起、边缘整齐、稍大的单菌落，进行过氧化氢和革兰氏染色鉴定。

1.3.2 过氧化氢鉴定在干净的载玻片上滴加2滴10%H2O2溶液，从培养的菌板上利用移液枪挑取单菌落置于H2O2溶液中。观察是否产生小气泡，出现气泡为阳性，不产生为阴性。保留结果为阴性的菌株，用于革兰氏染色鉴定。

1.3.3 革兰氏染色鉴定将 1.3.2 中的不产生气泡的菌按照革兰氏染色试剂盒的说明进行操作，在光学显微镜下观察其特性。紫色为革兰氏阳性，蓝色为阴性。保留阳性菌。

1.3.4 16SrRNA 基因序列鉴定 PCR 扩增采用通用引物 27F和 1 492R，使用 Golden Star T6 Super PCR Mix (1.1×)进行 PCR 扩增，模板选用1.1.5中保存的菌株DNA。具体要求见表3、4。

表 3 PCR 反应条件

表 4 PCR 反应体系

扩增后配制2%的琼脂糖凝胶进行电泳。PCR产物送至生工生物公司进行测序分析。将16S rRNA基因序列测定的结果上传到NCBI网站，进行BLAST同源性比对，确定菌株种类。

1.3.5 抑菌试验（1）配制固体 LB 培养基，灭菌并置于60 ℃的水浴锅中进行保温备用。

（2）将乳酸菌的单菌落移入MRS培养基中，于 37 ℃ 培养 16～24 h 作为种子液。取 0.1 mL 种子液接种到 0.9 mL灭菌的MRS培养液中，在37 ℃ 培养 16～24 h。将标准菌株（大肠杆菌、 鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌）接种于LB培养液中进行过夜培养。

（3）待步骤（1）准备的 LB琼脂培养基降到50 ℃后分别加入标准菌株作为指示菌。按照0.25%的比率进行添加，混合充分后倒入已安放好4个牛津杯的一次性培养皿中，每个皿加入14 mL培养基。20 min后，将牛津杯取出，4个孔各自注入不同的乳酸菌上清液100 μL。乳酸菌上清液加入后，常温放置2～3 h，待液面下降到培养皿皿底后，移到培养箱中培养。

（4）24 h 后，利用千分尺测量抑菌圈的直径，记录数据。

1.3.6 乳酸菌的耐酸试验（1）将 MRS 液体培养基配置好，使用稀盐酸和氢氧化钠溶液调节pH到2.5。

（2）将初步抑菌试验获得的菌株接种到培养液中，于 37 ℃ 培养 12～24 h。

（3）将已培养好的菌液涡旋 40 s，以 10 为倍数进行梯度稀释（0.1 mL 菌液加入到 0.9 mL 0.9% 氯化钠溶液中），逐步稀释到 10-6，取 100 μL菌液进行涂布，做3次重复试验，涂好的培养皿用封口膜进行封口，培养 36～48 h。

（4）取 100 μL 上述 的 菌 液 接种 到 900 μL pH 2.5的培养液中，培养2 h后取出。

（5）2 h 后取出，以 10 为梯度进行稀释，逐渐稀释到10-6，取100 μL涂板。同样，每个菌重复3次以上操作，用于对照。

（6）培养 36～48 h 后，统计菌落的数量。

1.3.7 乳酸菌的耐胆盐试验试验方法同 1.3.6。将pH 2.5的MRS溶液替换为0.25%的PBS胆盐溶液进行试验，同样设置3个重复。

2 结果与分析

2.1 乳 酸 菌 的 分 离 纯 化 及 初 步 筛 选通 过MRS琼脂培养基培养，进行分离纯化获得了可以产生溶钙圈、形态为圆形、边缘整齐、呈乳白色等的单菌落。经过氧化氢阴性和革兰氏染色阳性鉴定，共筛选到17株菌株，其鉴定结果见表5。

2.2 16 S rRNA 基因序列测定鉴定结果提取经初筛获得的17株乳酸菌的基因组DNA,利用通用引物扩增其16S rRNA基因序列。经测序后，在NCBI上进行BLAST同源性比对，结果如表6。表6显示本实验筛选的17株菌的相似度均达到97%及以上，其中，13株菌为植物乳杆菌，4株菌为粪肠球菌。

表 5 乳酸菌初步筛选结果

表 6 同源性比对结果

2.3 抑菌试验结果如表7 所示，这些菌株对标准菌株的抑菌圈直径之和均在41～45 mm之间，抑菌效果接近，其中编号为S4-1的菌株抑菌圈直径之和最大，为 44.3 mm。

表 7 不同对照组抑菌圈直径之和

由图1可得，筛选所获得的13株植物乳杆菌对3种病原菌均有抑制作用，抑菌圈直径接近14 mm，为中度敏感[11]的类型。不同植物乳杆菌对不同病原菌的抑菌效果存在一定的差异，其中植物乳杆菌S4-1对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强，抑菌圈直径超过15 mm。

图1 不同菌株的抑菌圈直径

2.4 乳酸菌的耐酸试验结果乳酸菌在 pH 2.5的培养液中培养2 h的存活率如图2所示。植物乳杆菌K1-6的耐酸性能最好。不同的菌株存活率差异较大，植物乳杆菌均有一定的耐pH的特性。

图2 乳酸菌菌株在 pH 2.5 处理下的存活率

2.5 乳酸菌的耐胆盐试验结果乳酸菌在胆盐浓度为0.25%的情况下保持2 h的存活率，如图3所示。S4-5和H3-6的乳酸菌存活率较高，K3-7的菌株存活率较低，不同菌株间的差异较大。

图3 乳酸菌菌株在 0.25%胆盐处理下的存活率

3 讨 论

海南岛地处热带，具有高温高湿的环境。这种炎热潮湿的气候一方面利于细菌的滋生，影响动物的健康养殖；另一方面高温高湿环境会影响动物肠道微生物的组成[12-13]，影响益生菌功效的发挥。目前针对热带地区益生菌筛选鉴定的研究较少，因此本研究选择海南文昌鸡的肠道内容物，通过16S rRNA基因序列测序、耐受试验和抑菌试验等一系列体外评价，筛选出在当地环境下抑菌效果较好的乳酸菌株，为开发热带畜禽养殖乳酸菌制剂提供材料。

目前研究表明，乳酸菌在畜禽肠道中，能够形成一层菌膜，帮助机体抵抗病原菌的侵袭，提高畜禽的抵抗力。养殖环境中存在的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及沙门氏菌是引起畜禽肠道疾病的主要病原菌[11]。因此在本试验中选择了这3种菌作为评价益生菌体外抑菌能力强弱的指示菌。试验的结果也表明文昌鸡肠道源的多株植物乳杆菌对这3株病原菌均具有抑菌活性。这符合前人大量关于乳酸菌抑菌的理论研究的结论，如乳酸菌会释放一些有机酸、细菌素等小分子物质，这些物质具有一定的抑菌能力[14]。本试验中筛选到植物乳杆菌S4-1对大肠杆菌、 鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌均具有抑菌效果，其对金黄色葡萄球菌的抑菌能力最强，具有开发为饲用乳酸菌的潜力。

拥有良好抑菌特性的外源乳酸菌要在畜禽肠道内发挥其生物学效应，还必须保证其能通过畜禽的胃进入肠道。畜禽的胃中具有低的pH环境，因此益生菌必须具有较高的酸耐受性[5]。而不同的菌株耐受低pH值的能力也不同，因此本试验对初步筛选的益生菌也进行了酸耐受性的试验。此外，畜禽肠道中具有较高浓度的胆汁，胆汁对细菌有较强的破坏能力,胆盐对乳酸菌的细胞膜具有溶解性，导致乳酸菌的死亡[15]。因此为了保证较多数的活菌能在肠道中生长和繁殖，发挥其生物学效应，必须筛选出对胆盐具有一定耐受力的乳酸菌。因此本研究在体外也评价了益生菌的胆盐耐受性。结果表明，植物乳杆菌S4-1具有较高的酸耐受性和一定的胆盐耐受性，综合抑菌效果最好。笔者认为该菌具有作为热带及其他地区畜禽饲用乳酸菌的潜力。

不同来源的益生菌具有不同的温度适应性，谢曈[16]等通过对10种益生菌研究发现其耐高温能力存在差异。菌株的高温耐受性有助于其在畜禽肠道生长和后期工业应用，也是优良益生菌的特性之一。相较于其他地区的乳酸菌，本实验所筛选出的植物乳杆菌S4-1来源热带地区，在耐高温方面具有先天优势。此外，前人研究表明，在鸡和猪的日粮中添加乳酸菌，均能有效改善肠道菌群结构，降低肠道中大肠杆菌数量[17-18]。但本实验尚未进行动物体内实验，植物乳杆菌S4-1对机体的影响有待进一步验证。