褪黑素在模拟微重力大鼠体内的药代动力学研究

冯利陈颖彭博陈腾飞李涛孙丽华

(1.国家开放大学医药学院,北京 100039;2.中国中医科学院中药研究所,北京 100700;3.北京市中医药防治重大疾病基础研究重点实验室,中国中医科学院医学实验中心,北京 100700)

太空飞行中的各种应激源,如微重力、太空辐射、狭小空间、振动、噪声等均会干扰机体的稳态,威胁航天员的身体健康。在多种应激因素存在下,航天员很容易产生焦虑、抑郁、睡眠障碍等症状。目前,针对航天因素导致的睡眠障碍的干预措施主要为给与镇静催眠药物、调节光线、锻练和使用传统中医药等[1]。但是,调节光线和锻练的作用有限,对睡眠障碍的干预目前仍主要依赖镇静催眠药物。但镇静催眠药物具有嗜睡等副作用,对航天员在轨工作的影响较大。寻找副作用小的改善睡眠障碍的防护措施一直是航天医学研究的热点之一。褪黑素是脑内松果体合成和分泌的一种内源性神经激素,具有诱导自然睡眠的功效。研究发现,除改善睡眠外,褪黑素还具有显著的调节免疫、抗氧化,抗炎、预防骨丢失、保护心血管、降压等[2-7]作用。这对航天员尤其有利,因为骨丢失、心脏功能受损、免疫功能下降也是在轨航天员的常见的功能障碍[8]。因此,褪黑素是治疗航天员睡眠障碍的一种很具有潜力的化合物。

航天特因环境可通过影响药物的转运、药物代谢酶[9]等影响药物的吸收、分布、代谢、排泄过程,导致药物产生不同于地表的药效和毒性改变。已发现其他药物在正常和模拟微重力条件下的药物半衰期、达峰浓度和生物利用度具有显著性差异[10]。褪黑素在关节炎模型大鼠体内的药物吸收总量以及平均滞留时间与正常对照组大鼠有显著性差异[11]。因此,研究褪黑素在微重力条件下吸收、分布、代谢和排泄的变化,对指导航天员合理、安全用药有重要意义。本研究首先建立了测定大鼠血浆中褪黑素浓度的UPLC-MS/MS方法,随后采用建立的方法研究了在模拟微重力和正常重力条件下,大鼠血浆中褪黑素的药物代谢动力学的差异,为航天员合理使用褪黑素提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

12只6周龄SPF级SD雄性大鼠,体重(200 ± 20)g,购买于北京维通利华实验动物技术有限公司【SCXK(京)2021-0006】。在昼夜各半循环照明,恒湿(59% ~ 62%),恒温(22 ~ 25℃)条件下适应性喂养4 d后开始造模。每只大鼠单笼饲养,自由饮食饮水,饲养于中国中医科学院中药研究所【SYXK(京)2019-0003】。实验遵循3R原则,本研究中的所有动物实验均经过中国中医科学院中药研究所动物伦理委员会批准(2021B152)。

1.1.2 主要试剂与仪器

异氟烷(批号:20200702),瑞普生物药业有限公司;褪黑素(批号:J19GS155217,纯度＞99%),上海源叶生物科技有限公司;盐酸苯海拉明(批号:100066-200807,纯度＞99%,内标),中国药品生物制品检定院;乙腈、甲醇为HPLC级(Thermo Fisher公司,美 国)。QTRAP5500 LC/MS/MS质 谱 仪、ExionLC AC超高效液相色谱仪器(AB SICEX公司,美国);Vortex涡旋混合仪(济南其林贝尔公司,中国);超速离心机(Sigma公司,德国);电子天平(十万分之一)(梅特勒-托利多公司,美国)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及实验干预

将12只大鼠按照随机原则分成两组(每组6只)。采用文献报道的尾吊法进行模拟微重力[12]。简述如下:将大鼠尾部用医用胶带固定,采用一细金属链通过鼠尾将大鼠悬吊于一金属笼,大鼠肢体与笼底呈30° ~ 35°角,后肢悬空。每只大鼠均单笼饲养,大鼠在笼中可自由活动,正常饮食饮水,正常重力组大鼠除不尾吊外,其他饲养条件同尾吊组大鼠,共建模21 d。建模结束后,给药前1 d,在异氟烷麻醉条件下,施行颈静脉插管术。大鼠给与褪黑素前禁食12 h,饮水不限制。褪黑素的给与剂量为0.27 mg/kg,灌胃给予。分别在给药前及给药后5、10、15、20、30、40 min以及1、1.5、2、4、6 h于颈静脉取血0.2 mL并置肝素化的EP管内,3000 rpm(4℃)离心10 min分离血浆,置于-20℃保存备用。

1.2.2 样品溶液配制

(1)标准储备液和标准工作液的配制:精密称取褪黑素对照品5 mg,用DMSO溶解并定容至10 mL,配制成5 mg/mL的储备液,再将此溶液用乙腈/甲醇(1∶1,v/v)混合液逐级稀释成1000、500、200、100、50 ng/mL的系列工作液,然后以大鼠空白血浆再次稀释成浓度分别为100、50、25、12.5、6.25、1和0.1 ng/mL的标准系列工作液。

(2)内标溶液的配制:精密称取盐酸苯海拉明10 mg,用乙腈/甲醇(1∶1,v/v)混合液稀释定容至10 mL,配成1 g/L的内标储备液,再使用乙腈/甲醇(1∶1,v/v)混合液稀释成100 ng/mL的工作液。

(3)质控溶液的配制:以1.2.2项下(1)中配制的浓度分别为0.1、25、50 ng/mL的标准系列溶液作为标准质控工作液进行分析方法的精密度、回收率及稳定性的验证。

1.2.3 血浆样品预处理

将大鼠血浆80 μL于室温解冻,加入160 μL乙腈/甲醇(1∶1,v/v)混合液,涡旋混匀,15 000 rpm离心3 min,取上清液180 μL,加入内标盐酸苯海拉明(100 ng/mL)20 μL,涡旋均匀后取上清液5 μL进样分析。

1.2.4 色谱与质谱条件

(1)色谱条件:色谱柱为ACQUITY UPLC BEH Shield RP C18(2.1 × 50 mm,1.7 μm);柱温:30℃;流动相A:水(含0.1%甲酸);流动相B:乙腈(含0.1%甲酸)。洗脱梯度:0 ~ 1.0 min,98% A;1.0 ~ 2.0 min,98% A ~ 2% A;2.0 ~ 5.0 min,2% A,5.0 ~ 5.1 min,2% A ~ 98% A;5.1 ~ 7.0 min,98% A;流速:0.3 mL/min。

(2)质谱条件:电喷雾离子源(ESI);离子喷射电压:5500 V;干燥气温度450℃;雾化气压力45 Psi;流速20 L/min;正离子多反应监测模式(MRM)检测。定量分析离子对褪黑素m/z233.3→m/z174.1,碰撞能10 eV,裂解电压80 V;盐酸苯海拉明m/z256.2→m/z167.2,碰撞能16 eV,裂解电压110 V,扫描时间200 ms。

1.3 统计学分析

采用 Phoenix WinNonlin软件(版本:5.2.1)对实验数据进行药代动力学拟合并计算相关参数。血药浓度及药代动力学参数用平均值 ± 标准差(±s)表示。采用SPSS软件20.0进行t检验,比较正常对照组和模拟微重力组大鼠的血浆药代动力学参数的差异,P＜ 0.05表示差异具有显著性。通过Origin软件8.5绘制各时间点血样中褪黑素的浓度与时间的关系曲线(药-时曲线)。

2 结果

2.1 方法学验证

2.1.1 专属性

精密量取大鼠空白血浆80 μL,按1.2.3所述方法处理、1.2.4所述条件分析,得褪黑素的色谱图1A;将浓度为1 ng/mL的褪黑素标准溶液和内标溶液加入空白血浆中,按以上方法进行样品处理和分析,得褪黑素的色谱图1B;取大鼠给与褪黑素(0.27 mg/kg)10 min后的血浆样品,按以上方法进行样品处理和分析,得色谱图1C。由图1知,褪黑素的保留时间约为3.35 min,内标盐酸苯海拉明的保留时间约为3.26 min,空白血浆中内源性物质不干扰褪黑素的测定,表明所建立的分析方法的专属性良好。

2.1.2 线性关系

以标准系列工作溶液的配制浓度及对应的待测物和内标的质谱峰面积比值进行回归,绘制标准曲线,得回归方程为Y = 0.00865X+0.0006.47817,权重W=1/X2,r2为0.9997,最低定量限(S/N ＞ 10)为0.1 ng/mL。

2.1.3 精密度与准确度

精密量取按1.2.2项下(3)中方法配制的低、中、高3个浓度(0.10、25.00、50.00 ng/mL)的标准质控工作液,每个浓度6份,按1.2.3所述方法处理、1.2.4所述条件分析,连续分析3 d,每天重新制作标准曲线并计算质控样品的实测浓度,与配制浓度比较,计算方法的准确度和精密度。结果显示,褪黑素低、中、高3个浓度测定结果的精密度和准确度符合生物样品测定要求(表1)。

表1 褪黑素在大鼠血浆中的精密度与准确度(±s,n = 6)Table 1 Precision and accuracy of melatonin in rat plasma(±s,n = 6)

表1 褪黑素在大鼠血浆中的精密度与准确度(±s,n = 6)Table 1 Precision and accuracy of melatonin in rat plasma(±s,n = 6)

浓度(ng/mL)Concentration(ng/mL)日内Intra-day 日间Inter-day测量值(ng/mL)Measured value(ng/mL)RSD(%) 准确度(ng/mL)Accuracy(ng/mL)测量值(ng/mL)Measured value(ng/mL)RSD(%) 准确度(%)Accuracy(%)0.10 0.10 ± 0.00 3.34 98.92 0.09 ± 0.01 10.99 89.43 25.00 24.46 ± 0.62 2.52 97.86 25.20 ± 2.00 7.95 100.83 50.00 51.99 ± 3.58 6.89 103.98 55.27 ± 3.22 5.83 110.55

注:AⅠ:大鼠空白血浆中褪黑素的色谱图;BⅠ:空白血浆加1 ng/mL褪黑素后褪黑素的色谱图;CⅠ:灌胃给与褪黑素(0.27 mg/kg)10 min后血浆中褪黑素的色谱图;AⅡ:大鼠空白血浆中内标盐酸苯海拉明的色谱图;BⅡ:空白血浆加1 ng/mL褪黑素后内标盐酸苯海拉明的色谱图;CⅡ:灌胃给与褪黑素(0.27 mg/kg)10 min后血浆中内标盐酸苯海拉明的色谱图。图1 大鼠血浆中褪黑素和内标盐酸苯海拉明的代表色谱图Note.AⅠ.Chromatogram of melatonin in blank plasma of rats.BⅠ.Chromatogram of melatonin after adding 1 ng/mL melatonin to blank plasma.CⅠ.Chromatogram of melatonin in plasma 10 minutes after intragastric administration of melatonin (0.27 mg/kg).AⅡ.Chromatogram of internal standard diphenhydramine hydrochloride in blank plasma of rats.BⅡ.Chromatogram of internal standard diphenhydramine hydrochloride after blank plasma plus 1 ng/mL melatonin.CⅡ.Chromatogram of internal standard diphenhydramine hydrochloride in plasma 10 minutes after intragastric administration of melatonin (0.27 mg/kg).Figure 1 Representative chromatogram of melatonin and internal standard diphenhydramine hydrochloride in rat plasma

2.1.4 加样回收率和基质效应

取大鼠空白血浆,按1.2.3所述方法处理、1.2.4所述条件分析,带入标准曲线,得褪黑素的量m1。将已知量(m2)的褪黑素加入到空白血浆中,制得含褪黑素低、中、高3个浓度(0.10、25.00、50.00 ng/mL)的标准质控工作液,每个浓度6份,同法操作,带入标准曲线,得褪黑素的量m3。通过(m3-m1)/m2计算加样回收率。结果显示,低、中、高3个浓度的加样回收率分别为(99.31 ± 7.90)%、(103.25 ± 3.72)%和(115.32 ± 8.50)%,RSD%分别为7.95%,3.58%和7.37%,符合生物样品分析要求。

取大鼠空白血浆,按1.2.3所述方法处理、1.2.4所述条件分析,带入标准曲线,得褪黑素的量n1。将已知量的褪黑素加入到空白血浆中,制得含褪黑素低、中、高3个浓度(0.10、25.00、50.00 ng/mL)的标准质控工作液,每个浓度6份,同法操作,带入标准曲线,得褪黑素的量n2。将用乙腈/甲醇(1∶1,v/v)混合液配制成的浓度为0.10、25.00、50.00 ng/mL的系列工作液,同法操作,带入标准曲线,得褪黑素的量n3。通过(n2-n1)/n3计算基质效应。结果显示,低、中、高3个浓度的基质效应分别为(92.50 ± 3.20)%、(105.61 ± 5.60)%和(110.80 ± 4.21)%,RSD%分别为3.46%,5.30%和3.79%,符合生物样品分析要求。

2.1.5 稳定性考察

按1.2.2项下(3)中方法配制低、中、高3个浓度(0.10、25.00、50.00 ng/mL)的标准质控工作溶液,考察样品在室温放置0 h及12 h、4℃放置24 h、-20℃冻存7 d及-80℃冻存1个月的稳定性。结果如表2所示,由表2可见,褪黑素在贮存和测定过程中稳定性良好。

表2 大鼠血浆中褪黑素的稳定性(±s,n = 6)Table 2 Stability of melatonin in rat plasma(±s,n = 6)

表2 大鼠血浆中褪黑素的稳定性(±s,n = 6)Table 2 Stability of melatonin in rat plasma(±s,n = 6)

浓度(ng/mL)Concentration(ng/mL)大鼠血浆中稳定性(%)Stability in rat plasma (%)室温0 h Room temperature 0 h室温12 h Room temperature 12 h 4℃ 24 h -20℃ 7 d -20℃ 1月-20℃ 1 mouth 0.10 105.82 ± 9.52 100.60 ± 10.20 98.74 ± 9.84 102.30 ± 10.54 110.22 ± 8.24 25.00 99.53 ± 7.73 102.93 ± 8.91 98.92 ± 6.92 103.92 ± 7.54 106.84 ± 8.20 50.00 103.84 ± 6.42 98.64 ± 7.82 105.41 ± 6.30 101.83 ± 7.22 99.72 ± 8.22

2.2 褪黑素在大鼠体内的药代动力学

参考褪黑素的人常用剂量,大鼠按0.27mg/kg灌胃给与褪黑素,给药后的平均血药浓度-时间曲线如图2所示,药代动力学分析结果如表3所示。由图2可见,褪黑素在模拟微重力组大鼠体内的消除较慢。由表3可见,两组大鼠血浆中褪黑素的达峰时间(Tmax)、0 ~ 6 h的药-时曲线下面积(AUC0→6h)、清 除 率(CL)和 平 均 滞 留 时 间(MRT0→6h)的差异有显著性(P＜ 0.05)。模拟微重力状态下,Tmax值是正常重力下的1.6倍,AUC0→6h值是正常重力下的3.1倍,CL为正常重力下的0.34倍,MRT0→6h为正常重力下的1.56倍。褪黑素在模拟微重力条件下的相对生物利用度为正常重力条件下的312.5%。

图2 褪黑素在大鼠体内的药-时曲线(±s,n = 6)Figure 2 Concenteation-time curve of melatonin in rats(±s,n = 6)

表3 大鼠口服给与褪黑素后的主要药动学参数(±s,n = 6)Table 3 Main pharmacokinetic parameters of melatonin after oral administration in rats(±s,n = 6)

表3 大鼠口服给与褪黑素后的主要药动学参数(±s,n = 6)Table 3 Main pharmacokinetic parameters of melatonin after oral administration in rats(±s,n = 6)

注:与正常对照组相比,*P ＜ 0.05。Note.Compared with the normal gravity group, *P ＜ 0.05.

参数Parameters单位Unit正常对照组Control group模拟微重力组Simulated microgravity group t1/2 h 1.96 ± 1.13 3.04 ± 1.34 Tmax h 0.11 ± 0.04 0.18 ± 0.03*Cmax ng/mL 2.79 ± 1.47 3.09 ± 1.70 AUC0→6 h ng.h/mL 1.36 ± 0.78 4.25 ± 2.69*AUC0→∞ ng.h/mL 1.63 ± 0.97 4.59 ± 3.01*V L/kg 526.60 ± 212.90 369.78 ± 177.51 CL L/(h·kg)260.52 ± 179.42 89.81 ± 44.39*MRT0→6 h h 1.19 ± 0.62 1.86 ± 0.11*MRT0→∞ h 2.31 ± 1.70 3.65 ± 1.39

3 讨论

前期研究显示,微重力或者模拟微重力对药代动力学有显著影响。在微重力或者模拟微重力状态下,体液头向分布可导致消化道血流减少,消化道内的相关激素、转运蛋白、酶、微生物的水平会发生改变,消化道的排空也会变慢,从而影响药物的吸收[9,13-17]。此外,因体液头向分布,肌肉的血流量减少,可导致药物的总体分布减慢。微重力也会影响肝中的药物代谢酶,从而影响药物的代谢和清除[18]。研究发现[19],在太空飞行7 d后,大鼠肝中P450酶的含量较对照组下降50%。

褪黑素为大鼠体内内源性的一种神经内分泌激素。本研究结果显示,在各个采样点(包括0点)正常对照组和模拟微重力组大鼠体内的褪黑素浓度均未表现出显著性差异。

药代动力学研究结果显示,与正常重力组大鼠相比,褪黑素在模拟微重力大鼠血浆中的药代动力学参数具有显著性差异,其中Tmax、AUC0→6h、CL、MRT0→6h的差异具有显著性。与正常重力组相比,在模拟微重力状态下,大鼠血浆中褪黑素的相对生物利用度显著增加。关于褪黑素在微重力或模拟微重力以及正常重力条件下药代动力学比较的早期研究较少,未检索到相关文献。本研究中的模拟微重力状态下和正常重力条件下褪黑素药代动力学参数的差异推测可能与模拟微重力变了大鼠胃肠道的菌群、肝和肠道的药物代谢酶活性、影响了褪黑素在胃肠道的转运,从而改变了褪黑素在大鼠体内的吸收、分布、代谢和消除速度,导致褪黑素的代谢及排泄速度减慢,在体内滞留时间延长,吸收增加,其具体机制需进一步研究。