基于成分的三七质量分析研究

吴 岚，韦柳卫，韦锦梅，钟 文，谭雨坪

（1.梧州市食品药品检验所，广西 梧州 543002；2.南宁市第六人民医院，南宁 530003；3.广西中医药大学，南宁 530200）

中药三七为五加科多年生草本植物三七［Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen］的干燥根及根茎［1］，别名有田七、参三七（山漆）、金不换等［2］，主要产于中国的广西壮族自治区、云南省等地。三七有止血神药、伤科要药之称，属于化瘀止血药类，具有化瘀止血、消肿定痛功效，并有止血不留瘀，化瘀不伤正的特点［3］。

三七的传统干燥工艺主要有窑洞烘烤和自然晾晒，操作虽简便，但过高的烘烤温度会降低三七中有效成分的含量且质量标准难以控制［4］。近年来，随着中药材干燥技术的改进，冷冻干燥法和热风干燥法被作为三七干燥的主要方法。质量及药效，采用基于成分评价的方法，对三七药材进行评价，并与传统饮片（热风干燥法）进行比较，以期为三七饮片的标准制定提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验仪器

Agilent 1260型液相色谱（美国安捷伦科技有限公司）、XN06-IV型凝血仪（武汉景川诊断技术股份有限公司）、K9840型自动凯氏定氮仪（济南海能仪器股份有限公司）、UV-1800型紫外分光光度计（日本岛津公司）。

1.2 试验药材

中药三七购于广东康美药业有限公司，经广西中医药大学谢臻副教授鉴定，为五加科植物三七的干燥根和根茎。

1.3 试验材料

三七皂苷R（1批号110745-201921）、人参皂苷Rg1（批号110703-202034）、人参皂苷Re（批号110754-202129）、人参皂苷Rb（1批号110704-202129）、人参皂苷Rd（批号111818-202104）、芦丁（批号100080-202012）、没食子酸（批号110831-201906）对照品，均购自中国食品药品检定研究院。

1.4 药材处理

3种干燥方法的工艺流程如表1所示，鲜三七原料源自同一批次三七，随机分成3份进行干燥处理，干燥至含水量2%以下。

表1 三七不同干燥加工方法

1.5 试验方法

1.5.1 三七5种皂苷含量测定

1）对照品溶液制备。精密称定三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1和Rd对照品适量，以70%乙醇溶解稀释成不同浓度的溶液，在波长203 nm处测定峰面积。

2）供试品溶液制备。称取三七样品粉末1.0 g，加入70%乙醇溶液25 mL，超声提取40 min，过滤离心，合并2次提取液定容至25 mL，用0.45 μm滤膜过滤，得到供试品溶液。

3）色谱条件。色谱柱：Agilent Zorbax型SB-C18（5 μm，4.6 mm×250.0 mm）；流动相：乙腈（A），水（B）；梯度洗脱程序为0～18 min：20%A，18～42 min：45%A，42～52 min：54%A，52～60 min：56%A；检 测 波 长 ：203 nm；柱温：30℃；进样量：10 μL；流速：1 mL/min。

1.5.2 三七多糖含量测定

1）对照品溶液制备。精密称取适量无水葡萄糖，加水稀释至不同浓度置25 mL比色管中，依次加入1 mL 6%的苯酚溶液和5 mL浓硫酸，混匀，放置至室温，在L=1 cm、波长490 nm处测定吸光度。

2）供试品溶液制备。称取三七粉末样品2.0 g，按料液比1∶25加入去离子水超声40 min，离心取上清滤液；取滤渣加同比例的水，75℃水浴1 h，3 500 r/min离心12 min，合并上清液，静置抽滤。上清液除蛋白和冷冻干燥方法参考文献［5］。

3）总多糖含量测定。精密称取冻干样品5 mg加水定容至50 mL，精密吸取1 mL置于25 mL比色管中，依次加入水、6 %的苯酚溶液各1 mL，摇匀后加入5 mL浓硫酸，混匀，放置至室温，在L=1 cm、波长490 nm处测定吸光度。

1.5.3 三七总黄酮和总酚含量测定

1）对照品溶液制备。精密称取适量的芦丁、没食子酸对照品，加入乙醇稀释成不同浓度，分别在510、273 nm波长下测定其吸光度。

2）供试品溶液制备。称取三七样品0.5 g，70 %乙醇，超声30 min，离心取上清液，重复提取2次，合并上清液定容至25 mL，得供试品溶液。

3）总黄酮和总酚含量测定。取上述供试品溶液1 mL，加入70%甲醇4 mL，以5 mL 70%甲醇作为空白对照，在L=1 cm、波长256、273 nm处测定吸光度。

1.5.4 数据分析 采用SPSS 22.0软件进行显著性分析、主成分分析和双变量相关性分析，用均数±标准差（）表示。对相同指标不同处理进行Duncan 0.05多重分析，采用Prism 8.0软件绘图。

2 结果与分析

2.1 方法学考察

2.1.1 5种皂苷类成分方法学考察 精密度试验：三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd的RSD分别为1.05%、1.20%、0.89%、1.52%、1.86%；重复性试验：三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd的RSD分别为0.92%、1.21%、1.35%、1.72%、0.95%；稳定性试验：三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd在0、2、4、6、8、12、24 h的RSD分别为1.28%、2.05%、1.62%、1.90%、1.62%；加样回收率试验：三七皂苷R1、人参皂 苷Rg1、Re、Rb1、Rd的 平 均 加 样 回 收 率 分 别 为100.05%、98.40%、97.85%、99.06%和100.12%，RSD分别为2.50%、1.89%、2.61%、1.98%和2.12%。

2.1.2 总多糖、总黄酮、总酚方法学考察 精密度试验：总多糖、总黄酮、总酚的RSD分别为1.78%、2.05%、1.64%；重复性试验：总多糖、总黄酮、总酚的RSD分别为1.83%、2.02%、1.47%；稳定性试验：总多糖、总黄酮、总酚在0、2、4、6、8、12、24 h的RSD分别为2.30%、1.85%、2.26%；加样回收率试验：总多糖平均加样回收率为98.75%，RSD为2.40%。总黄酮平均加样回收率为98.62%，RSD为2.48%。总酚平均加样回收率为100.42%，RSD为2.15%。

2.2 高效液相色谱

对照品溶液和三七样品溶液的高效液相色谱见图1。由图1可知，各成分分离度良好。

图1 对照品溶液（a）和三七样品溶液（b）的高效液相色谱

2.3 三七5种皂苷含量测定结果

以检测浓度（x）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程分别为R1：y=2 486.9x+18.512（r2=0.999 5）；Rg1：y=3 210.2x-2.645（r2=0.999 8）；Re：y=3 369.8x+6.526（r2=0.999 3）；Rb1：y=22 519.2x-3.581（r2=0.999 5）；Rd：y=3 379.8x-0.952（r2=0.999 2）。结果表明，在0.448～0.028 mg/mL水平上，各皂苷与峰面积线性关系良好。

皂苷类成分含量测定结果见表2。从表2可以看出，80℃热风干燥的三七R1含量显著高于60℃热风干燥、冷冻干燥的三七，Rg1、Rb1、Rd以及总皂苷含量均显著低于冷冻三七粉；总皂苷含量：冷冻干燥三七＞60℃热风干燥三七＞80℃热风干燥三七。冷冻干燥的三七与60℃热风干燥三七相比，Rg1、Rb1含量显著提高8.37%、6.33%，R1含量降低2.48%，冷冻干燥三七中Re和Rd含量高于60℃热风干燥的三七，但无显著差异。

表2 皂苷类成分含量测定结果（，n=3） （单位：%）

表2 皂苷类成分含量测定结果（，n=3） （单位：%）

注：同列数据后不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。表3同

处理S1 S2 S3 R1 1.21±0.08 c 1.36±0.06 a 1.18±0.12 bc Rg1 4.18±0.82 bc 3.94±0.15 b 4.53±0.60 a Re 0.41±0.030 a 0.46±0.012 a 0.49±0.018 a Rb1 3.32±0.48 b 3.15±0.71 c 3.53±0.36 a Rd 0.75±0.54 a 0.66±0.13 b 0.78±0.25 a总皂苷9.76±1.21 c 9.54±1.54 bc 10.60±2.28 a

2.4 三七总多糖、总黄酮、总酚和总蛋白含量测定结果

以检测浓度（x）为横坐标、吸光度（y）为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程分别为多糖：y=12.750x+0.098 0（r2=0.999 1）；总黄酮：y=24.526x+0.086 2（r2=0.999 2）；总 酚 ：y=32.685x+0.049 2（r2=0.999 4）。结果表明，在12.0～72.0 μg/mL水平上，多糖与吸光度线性关系良好，在2.5～15.0 μg/mL水平上，总黄酮、总酚酸和吸光度线性关系良好。

经紫外分光光度法检测结果见表3。如表3所示，其中冷冻干燥的三七总黄酮含量显著低于其他2种干燥方式，总酚含量显著低于60℃热风干燥方式，60℃热风干燥的三七总多糖含量显著高于其他2种干燥方式。

表3 三七总多糖、总黄酮、总酚和总蛋白含量测定结果（n=3） （单位：mg/g）

2.5 主成分分析

采用主成分分析法考察干燥方式与成分之间的相关性，如表4、表5所示，以三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd、总皂苷、总多糖、总黄酮、总酚为考察指标，分别对3种干燥粉进行分析。共提取出特征值大于1的2个主成分，累计方差贡献率高达97.677%，具有较强的代表性，能够客观反映不同干燥处理的三七饮片的内在品质。故选用上述2个成分对干燥饮片进行综合评价。

表4 主成分特征值和方差贡献率

表5 主成分相关系数

结合主成分特征值和9个成分的相关系数，得到2个主成分方程：Y1=0.405X1-0.293X2+0.402X3+0.201X4+0.394X5+0.256X6-0.076X7-0.375X8-0.158X9，Y2=0.016X1-0.356X2+0.038X3-0.445X4+0.108X5+0.398X6+0.504X7+0.184X8+0.472X9，其 中X1（ 总 皂苷）、X（2R1）、X（3Rg1）、X（4Re）、X（5Rb1）、X（6Rd）、X7（总多糖）、X（8总黄酮）、X（9总酚）分别代表原始变量标准化后的变量。主成分Y1与总皂苷、Rg1、Rb1、Re、Rd成正相关，贡献值为60.185%；主成分Y2与总皂苷、Rg1、Rb1、总黄酮、总多糖、总酚、Rd呈正相关，贡献值为37.492%。根据公式Z（综合评分）=60.185%Y1+37.492%Y2，得出三七的综合评分，结果见表6。基于主成分分析和综合得分结果得出，80℃热风干燥三七粉综合水平最高，质量最优。

表6 三七样品主成分分析综合得分

3 讨论

试验中，80℃热风干燥与冷冻干燥相比在生产过程中缩短了加工时间，主成分总多糖、总黄酮和总酚得以保留，具有显著差异性（P＜0.05）。但是冷冻干燥法与热风干燥法相比，对热敏成分影响较小，可显著减少皂苷的流失（P＜0.05）。冷冻干燥的三七与60℃热风干燥的三七相比，Rg、Rb含量显著提高8.37%、6.33%，Re和Rd含量高于热风干燥的三七。本试验在3种加工方法对5种单体皂苷含量的测定过程中发现，热风干燥的三七R1含量高于冷冻干燥，其他单体皂苷成分含量不同程度地少于冷冻干燥方式，所以在热风干燥工艺环境下发生了部分皂苷的转变。不同处理方式引起的成分变化直接使药效产生差异。

综上所述，不同干燥方式处理三七会引起指标成分的变化，进而导致药效差异。在主成分分析中80℃热风干燥的三七综合排名最高，代表其内在品质较好，但是不同方法炮制的三七其成分也不同，这也就解释了热风干燥三七在各药效中不是最佳的原因。因此，在研究新型饮片与传统饮片差异时，不能仅将化学成分作为评价饮片品质的指标，要在成分差异基础上进一步运用中医药理论结合现代工艺技术探索加工方法影响药材药用功效的机理，可为高品质中药材生产提供依据。