四唑染色法快速测定北乌头种子生活力

隋 昕，于 营，鲁海坤，于芸泽，郭 靖，姜业成

（1.中国农业科学院特产研究所，长春 130112；2.吉林省农业科学院资源与环境研究所，长春 130112）

北乌头（Aconitum kusnezoffii）又称蓝靰鞡花、草乌、鸡头草等，是毛茛科乌头属多年生草本植物，块根为胡萝卜形或圆锥形，7—9月开花，种子为扁椭圆球形［1］，在中国主要分布于内蒙古、河北、山西以及东北地区［2］。

北乌头主要以根入药，性味热、苦、辛，具有免疫调节、强心、镇痛消炎、抗肿瘤等作用［3］。由于北乌头在医学领域中应用广泛，需求量不断增大，但其野生资源有限，生态环境的破坏使其自然繁殖能力减弱，且近年来对北乌头资源的过度挖采，野生资源所剩无几［4］。人工种植北乌头，可以在保护野生种质资源的同时满足市场的供应需求，主要包括种子繁殖和块根栽植2种方式。现阶段生产上大多以块根栽植为主，北乌头种子具有休眠特性，需要3个月时间打破休眠，在适宜条件下萌发，不能快速通过种子发芽率的情况判断种子质量［5］。利用四唑染色法（TTC）测定北乌头种子生活力，可快速判断种子质量，为生产和种子保存提供了参考。

TTC染色法被列进《国际种子检验规程》和ISTA，因其操作方便、不受种子特性影响、节省时间等特点，是广泛使用的一种测定种子活力的方法［6，7］。目前，未见TTC法测定北乌头种子生活力的系统研究报道。为了提高北乌头种子的播种效率、保存北乌头的种质资源以及对北乌头种子进行深入研究，本研究在正交试验设计的基础上，对TTC法测定北乌头种子生活力的试验条件进行了优化筛选。

1 材料与方法

1.1 试验材料

北乌头种子采购于黑龙江省伊春市，采购后放入4℃冰箱保存备用。

1.2 TTC染色方法

1.2.1 正交试验设计运用L9（34）的4因素3水平正交试验法，设置3个水平以探究TTC染色法测定北乌头种子活力，分析浸种时间、TTC浓度、染色温度、染色时间4个因素对种子染色效果的影响，并确定种子染色的最适条件（表1）。

表1 北乌头种子活力测定正交试验因素与水平

1.2.2 染色试剂的制备 磷酸缓冲溶液的制备：母液1，称取107.46 g Na2HPO4·12H2O充分溶解于3 L双蒸水中；母液2，称取31.21 g NaH2PO4·2H2O充分溶解于2 L双蒸水中。取2 440 mL母液1和1 560 mL母液2混合，即为pH 7.0的磷酸缓冲溶液。

不同浓度TTC染色液的制备：分别称取0.2、0.6、1.0 g的四唑粉剂溶于200 mL的磷酸缓冲液中，即可制备出0.1%、0.3%、0.5%浓度的TTC染色液。随后将装有染色液的瓶子用锡纸包裹，避光防止溶液变质，放入4℃冰箱备用。

1.2.3 种子的预湿处理 在盛有等体积双蒸水的烧杯中放入北乌头种子，并使种子完全浸没，在室温下种子浸泡5、10、15 h，使北乌头种子吸胀。到达吸胀时间后，沥水、取出预湿处理的北乌头种子，用滤纸将种子表面水分吸干，随机取50粒种子为1个处理组合，重复3次。

1.2.4 种子的染色 将种子纵向对半切开，取其中1/2放入培养皿中，在培养皿中倒入等体积的0.1%、0.3%、0.5%浓度的TTC染色液，完全淹没种子染色。将恒温箱调至25、30、35℃，染色时间分别为5、10、15 h。染色完成后倒出染色液，双蒸水冲洗种子3次后用滤纸吸干表面水分。

1.2.5 观察染色效果 在40倍解剖镜下观察北乌头种子的染色效果，根据北乌头种子染色效果判断种子生活力情况：若种子染成红色或淡粉色，可判断为有生活力种子；若种子不变色，可判断为无生活力种子。

种子生活力=（有生活力的种子数/测定种子总数）×100%

1.3 数据的分析处理

运用SAS分析软件进行数据的分析处理，利用Excel软件进行数据整理。

2 结果与分析

2.1 正交试验结果分析

北乌头种子经TTC染色法测定的结果见表2。处理组合3（A1B3C3D3）条件下测定北乌头种子生活力最高，为100.00%；处理组合6（A2B3C1D2）、处理组合8（A3B2C1D3）条件下测定北乌头种子生活力较高，均为98.00%以上。这3个处理组合条件下测定结果无显著差异，且染色效果较好，其余处理组合条件下种子生活力测定结果均在95.00%以下，且处理间差异显著。处理组合1（A1B1C1D1）条件下测定北乌头种子生活力最低，为37.33%，在该条件下仅有少数的北乌头种子被染成淡粉色。

2.2 极差分析

对正交试验结果进行极差分析（表2），TTC法测定北乌头种子活力时各因素的影响极差值依次为R1=7.78、R2=19.33、R3=3.78、R4=39.78，且R4＞R2＞R1＞R3，即染色时间＞TTC浓度＞浸种时间＞染色温度。因此，TTC染色法测定北乌头种子生活力时受染色时间影响最大，其次是TTC浓度、浸种时间，受染色温度影响最小。

表2 正交试验测定北乌头种子活力的结果

通过进一步分析，可依据T值的最大值来判断TTC染色法测定北乌头种子活力的最适条件。浸种时间（因素A）中TA2=254.67，是TA1、TA2、TA3中的最大值，则最适宜的浸种时间为12 h；TTC浓度（因素B）中TB3=262.67，是TB1、TB2、TB3中的最大值，TB2=260.66与TB3相差2.01，差距较小，则最适宜的TTC浓度应为0.3%；染色温度（因素C）中TC2=246.67，是TC1、TC2、TC3中的最大值，则最适宜的染色温度为30℃；染色时间（因素D）中TD3＝288.00，是TD1、TD2、TD3中的最大值，则最适宜的染色时间为15 h。综上所述，各因素的最适条件分别为浸种时间12 h、TTC浓度0.3%、染色温度30℃、染色时间15 h。

2.3 数据的方差分析

用方差分析对正交试验结果数据进行处理（表3），试验中各因素对种子染色的影响均有显著性（P＜0.01），即浸种时间（因素A）、TTC浓度（因素B）、染色温度（因素C）和染色时间（因素D）对TTC染色法测定北乌头种子活力时有显著影响。

表3 方差分析结果

3 结论

3.1 各因素对染色效果的影响

在TTC染色法测定北乌头种子活力时，4个因素对染色结果的影响均有显著性，影响大小依次为染色时间＞TTC浓度＞浸种时间＞染色温度。王志威等［8］研究表明，分析头花蓼种子TTC染色的最适条件时各因素对染色效果的影响表现为染色温度＞染色时间＞TTC浓度；雷慧霞等［9］研究表明，分析芍药种子TTC染色的最适条件时各因素对染色效果的影响表现为浸种时间＞染色时间＞TTC浓度＞染色温度＞浸种温度；邢丽伟等［10］在优化TTC染色测定北细辛种子生活力的条件时发现，TTC农度＞染色温度＞染色时间＞浸种时间。不同种类的种子所含脱氢酶含量不同，遗传物质和特性也有明显差异，因此，TTC染色测定不同物种的种子时，各因素对种子染色效果影响大小不同。

3.2 TTC染色法测定北乌头种子生活力的最适条件

利用正交试验法测定的不同处理组合中，处理组合3（种子生活力100.00%）、处理组合6（98.67%）、处理组合8（99.33%）3个处理组合染色效果较好且差异不显著，是TTC染色法测定北乌头种子生活力的适宜条件。综合环境污染、试验成本、试验效果等问题，在适宜组合中处理组合8为最优组合，即北乌头种子浸泡18 h后0.3%TTC染色液25℃染色15 h。依据正交试验的结果，各因素的最适条件分别为浸种时间12 h、TTC浓度0.3%、染色温度30℃、染色时间15 h。与处理组合8相比，浸泡时间和染色温度有所不同。处理组合8的浸种时间为18 h，其TA3＝242.00；浸泡时间的最适条件为12 h，其TA2＝254.67，二者相差12.67，相差较大，因此浸泡时间的最适条件为12 h。处理组合8的染色温度为25℃，其TC1=235.33；染色温度的最适条件为30℃，其TC2=246.67，二者相差11.34，相差较大，因此染色温度的最适条件为30℃。综上所述，种子浸泡12 h后，在30℃下用0.3%TTC染色液避光染色15 h为北乌头种子TTC染色的最适条件。