昌江石斛内生抗菌活性菌株筛选与鉴定

高芳美，陈夏诗，陈茂楠，高芳建，杨 文

（海南医学院，a.第一临床学院；b.第二临床学院；c.基础医学与生命科学院，海口 571199）

植物内生菌是指在其生活的全部阶段或某一阶段存在于健康植物体内，不会引起寄主植物明显病害症状的微生物，它与植物在长期的生长进化过程中形成了一种互惠共生相互依存的关系［1］。近年来，随着研究的不断深入，人们发现越来越多的植物内生菌中部分内生菌能够合成与宿主植物相同或相似的活性成分或是合成一些新的生物活性物质［2-4］，其所产生的活性物质在抗肿瘤、抑菌、抗氧化、抗炎镇痛等方面发挥重要的作用［5，6］，其中一些已被证明在新药发现中起到非常重要的作用［7］。中国药用植物资源极为丰富，其中蕴含着大量不为人知的内生菌类群，它不仅促进药用植物的生长，提高药用植物的生物防治能力和抗逆性而且影响药材道地性［8］，是新药及新的抗耐药微生物药物发现的良好资源［9-11］。因此，这一宝贵内生菌类群亟待人们去探索与开发，植物内生菌作为新型药物的筛选源具有巨大潜力。

石斛（Dendrobium）属兰科植物，作为传统的中药之一，其含有丰富的生物碱，多糖，氨基酸，酚类等活性成分，药理研究发现，石斛具有抗氧化、抗炎、降血糖、调血脂、抗菌等功效［12，13］，因产地、种质、年龄等不同显著影响其化学成分，因而药效作用及内生菌的种类也不尽相同［14，15］。昌江石斛（Dendrobium changjiangense），别名万丈须，是中国海南省特有石斛物种之一［16，17］，主要分布于海南省的三亚、保亭、东方、乐东、昌江等地区，杨柳等［18］对昌江石斛不同部位进行抗菌活性筛选研究，发现昌江石斛的乙酸乙酯部位对白假丝酵母菌具有较强抗菌效果。但昌江石斛的内生菌方向的研究鲜见报道。本研究对海南霸王岭国家森林公园的野生昌江石斛进行内生细菌的分离，从中筛选和鉴定出具有抗菌活性菌株，可成为人们寻找天然药物和生物活性物质的新方向，同时在保护野生与濒危药用植物，新药研究等方面也具有重要价值。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 试验材料 新鲜野生昌江石斛采自昌江黎族自治县境内的霸王岭，经海南省霸王岭林业局鉴定为兰科石斛属昌江石斛；指示菌株金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、白假丝酵母菌（Candida albicans）、大肠埃希菌（Escherichia coli），广东环凯微生物公司；马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基、马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）培养基、营养琼脂（NA）培养基、营养肉汤（NB）培养基，青岛高博园科技公司；DNA提取试剂盒、琼脂糖、核酸染料，上海生工公司；次氯酸钠（分析纯），西陇化工股份有限公司；无水乙醇（分析纯），广州化学试剂厂。

1.1.2 试验仪器HR40-11 A2型生物安全柜（青岛海尔生物医疗股份有限公司），THZ-300C型恒温培养摇床（上海一恒科学仪器有限公司），510P型超声波清洗器、全自动高压灭菌器［美国致微（厦门）仪器公司］，生化培养箱（上海博迅仪器有限公司），Vortex-2型涡旋混匀仪（上海沪析实业有限公司），Mastercycler nexus GX2型PCR仪、5418R型高速离心机（德国艾本德股份公司），DYY-6C型电泳仪（北京六一生物技术有限公司），电子天平（诸暨市超泽衡器设备有限公司），liB-100型恒温金属浴锅（杭州博日科技有限公司），Tanon 1600型全自动数码凝胶成像系统（上海天能公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 植物材料表面消毒 取新鲜昌江石斛根、茎、叶，用流水冲去表面泥土，晾干。在无菌环境下，先用无菌水冲洗3遍，再依次用75%乙醇和2.5%次氯酸钠分别浸泡30 s和4 min，最后用无菌水漂洗3遍，无菌滤纸吸干表面的水分，取最后一次漂洗的无菌水涂布于分离培养基上作为对照，28℃避光培养3～5 d，检测植物组织表面消毒是否彻底。

1.2.2 内生细菌的分离与纯化 在无菌环境下，将表面消毒的植物组织切成5 mm小段，接种于NA培养基上。37℃培养2 d，待组织块断面边缘长出菌后，转移到新鲜培养基上进行划线分离纯化，获得纯种细菌，并于4℃条件下保存。

1.2.3 代谢产物的提取 用接种环从固体培养基上蘸取单个菌落细菌后，接种于液体培养基NB中，放入恒温摇床中培养，37℃、160 r/min，摇床振荡3 d，得到含有昌江石斛内生菌及其代谢产物的发酵液，将发酵好的培养液放入超声波清洗器，超声45 min，使细菌更好地破碎、溶解于培养液中。该菌液置于紫外灯下照射45 min，13 000 r/min离心10 min，重复离心2次。取上清液，经0.22 μm过滤器过滤，得到不含菌的发酵液。

1.2.4 指示菌的复苏 无菌条件下，用75%乙醇消毒西林瓶表面，开盖后加入复苏液，吸取适量移至固体培养基和液体培养基中（大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌：NA/NB，37℃，18 h；白假丝酵母菌：PDA/PDB，37℃，48 h），复苏后的菌种传代3次后置于4℃冰箱备用。

1.2.5 琼脂平板法测定代谢产物抑菌活性［19］吸取200 μL处理过的昌江石斛内生细菌发酵液于无菌空培养皿中，加入50～60℃的无菌营养琼脂固体培养基，混匀，制成含发酵液的无菌平板和空白对照平板。吸取10 μL培养好的3种指示菌菌液滴至滤纸片上，冷风吹干，制成含菌纸片，轻轻贴于含有内生细菌发酵液的平板上，每个发酵液平板做3次平行试验，每处理设置3次重复。最后将接种好的培养皿放置在37℃恒温条件下培养，24～48 h后观察细菌生长现象，计算抑菌率。抑菌率=（L0-L1）/L0×100%。其中，L0为空白对照中指示菌长度，L1为含有内生菌发酵液的指示菌长度（除去纸片自身长度）。

1.2.6 内生活性菌的初步鉴定 根据菌落特性、菌体形态特征及革兰染色等对内生活性菌进行初步鉴定。

1.2.7 菌种的鉴定 对活性菌株16S rRNA基因片段 进 行PCR扩 增（上 游 引 物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下 游 引物1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）。细菌PCR体系如表1所示，PCR反应条件：①94℃预热1 min；②循环：94℃变性1 min、58℃退火40 s、72℃延伸1 min，共经历35个循环；③72℃延伸10 min；④4℃保温。成功扩增的DNA送至上海生物工程股份有限公司测序，收到拼接好的序列后利用NCBI（National Center for Biotechnology Information）上用BLAST（局部序列比对基本检索工具）软件的N-BLAST（核苷酸序列比对检索）功能，将所测内生细菌的16S rDNA序列与数据库内已知的数据比对检索，采用MEGA 5.0软件构建系统进化树，分析菌株的系统发育学特征并找到相似性高的菌属。

表1 PCR反应体系

1.3 数据处理

抑菌试验重复3次，所得数据采用SPSS 22.0软件进行分析和处理，计量资料以均数±标准差()表示，采用方差分析中的多重比较对不同的内生菌发酵液对同一指示菌的抑菌率进行比较。

2 结果与分析

2.1 昌江石斛内生细菌的分离结果

对昌江石斛植株体进行内生细菌分离（表2），如表2所示，共分离得到内生细菌10株，其中根5株、茎3株、叶2株。由此可见，昌江石斛根部分离的内生细菌最多，叶部最少。

表2 昌江石斛内生菌的分离情况

2.2 昌江石斛内生细菌的抗菌活性测定结果

将分离得到的昌江石斛内生细菌分别对3种指示菌（大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、白假丝酵母菌）进行初步的体外抗菌活性研究，结果见表3。如表3所示，通过不同的内生菌发酵液对同一指示菌的多重分析，10株内生细菌中有2株具有一定的抑菌效果，其中有1株对3种供试指示菌有抑菌效果，另一株仅对2种指示菌有抑菌效果。由表3可以看出，对大肠埃希菌具有较好抑菌效果的2个菌株中，抑菌率C-06＞C-05，对金黄色葡萄球菌具有较好抑菌效果的是C-06，对白假丝酵母菌具有较好抑菌效果的2个菌株中，C-05与C-06抑菌率相当。昌江石斛内生菌对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、白假丝酵母菌的拮抗作用见图1、图2、图3。从图1至图3可以看出，C-06菌株的抗菌谱相对较好，对3种供试指示菌均有抑菌活性。

图3 昌江石斛内生菌对白假丝酵母菌的拮抗作用

表3 昌江石斛内生细菌对3种供试菌种的抑菌率（n=9）（单位：%）

图1 昌江石斛内生菌对大肠埃希菌的拮抗作用

图2 昌江石斛内生菌对金黄色葡萄球菌的拮抗作用

2.3 昌江石斛内生活性菌株的初步鉴定结果

按照菌落特点和镜下形态学特征的不同，昌江石斛分离出的内生细菌10株，昌江石斛内生活性菌株的形态特征、菌落及革兰染色结果见表4、图4和图5。C-05菌株为革兰染色阳性杆菌，乳白色干燥型菌落，C-06菌株为革兰染色阴性杆菌，淡黄色粘液型菌落。

图4 昌江石斛分离的内生菌株的菌落

图5 昌江石斛内生菌革兰染色

表4 内生细菌的形态特征

2.4 昌江石斛分子生物学鉴定结果

昌江石斛内生菌DNA扩增后进行电泳试验，片段大小与2 000 DNA Marker的1 500 bp相对应，由此可知所得片段大小约为1 500 bp左右（图6）。测序得到的内生菌DNA序列分析和BLAST比对，采用MEGA 5.0软件构建出系统进化树（图7），结果显示，菌株C-05与芽孢杆菌属（Bacillussp.）的相似性为99%，C-06与类芽孢杆菌属（Paenibacillussp.）的相似性为99%。根据比对结果，可以得出活性菌株隶属2个属，分别是芽孢杆菌属和类芽孢杆菌属，C-05鉴定为芽孢杆菌属，C-06鉴定为类芽孢杆菌属。

图6 内生活性菌株DNA提取物PCR产物凝胶电泳扩增结果

图7 昌江石斛内生抗菌活性菌株系统发育树

3 小结与讨论

从昌江石斛的根、茎、叶中分离得到10株内生细菌中，以根部最多，茎部次之，叶部最少。采用大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、白假丝酵母菌作为供试指示菌分别对10株内生细菌进行抗菌活性测定，筛选出2株具有抗菌活性的菌株，其中C-06菌株对3种指示菌都有抗性，显示抗菌活性强的特性。研究结果表明，内生菌在昌江石斛中分布存在差异，具有抗菌活性的菌株比例比较高，抑菌作用较强的菌株分布在根、茎中。

采用细菌16S rRNA基因序列对分离出的具有抗菌活性菌株进行分子生物学鉴定和遗传进化分析发现，这些内生菌分布在芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属中，其中对3种指示菌都有抑制作用的C-06菌株与Paenibacillus具有密切的亲缘关系。

内生菌普遍存在于植物组织中，内生菌的数量和种类与植物体不同组织、年龄、生境等有相关性［20］，石斛作为常用名贵中药材，石斛的内生菌在其生长史中发挥着至关重要的作用，王珊珊等［21］对6个不同种的石斛茎组织进行分离，获得内生菌165株，分属20个菌属，43个菌种，其中短小杆菌属和芽孢杆菌属所占比例最高。高阳等［22］从金钗石斛中分离出的芽孢杆菌属和类芽孢杆菌属具有缓解高度干旱胁迫对其种子萌发的影响，Mayer等［7］研究发现植物内生菌中的类芽孢杆菌属等对植物表现出菌株特异性的植物生长促进作用。芽孢杆菌属因其能分泌多种天然代谢产物，具有防治植物病虫害、促进生长、抵抗不利生长环境等作用，逐渐成为研究的重点［23］。本研究通过比较昌江石斛内生菌和昌江石斛不同部位的抗菌活性，发现其内生菌的抗菌活性与石斛本身的抗菌活性相当或更优［18］，一直以来人们获得药物的主要途径靠的是从药用植物中提取活性物质，但药用植物生长周期长、人为的过渡采集及生长环境被破坏等因素，野生石斛资源日趋减少，均会导致天然药物资源供不应求。目前许多研究发现，植物内生菌可分泌产生和宿主植物相同、相似的活性物质，同时内生菌具有繁殖周期短、生长速度快、易于工业化生产等特点［24］，因此活性菌株有望作为医药的生产菌种，用于现代工业发酵中生产出昌江石斛的活性物质，为筛选具有广谱性和选择性的抗菌药物提供了资源。

本研究中对分离的内生细菌的抑菌作用机理只是从抑菌现象上进行了分析，但对内生菌的次生代谢产物以及抑菌机理未进行深入的研究，下一步的研究方向：①提取、分析和鉴定活性菌株的代谢产物，需要深入研究其抑菌作用；②体外具有抗菌活性的菌株，其体内抗菌活性如何；③从植物中分离出多株内生细菌，但有些菌株在传代中逐渐失活，考虑在试验条件上不一定适合所有内生菌的生长，可通过模拟石斛植物体内环境培养细菌，以期获取更多的内生菌群；④在石斛等植物的内生菌研究方面，大多采用常规的组织分离方法，获得的是好氧型微生物且获得的菌株有限，如加强厌氧型微生物的分离鉴定、结合新一代的分子生物测序分析技术对不同产地、不同时期的昌江石斛等进行全面深入研究，可发掘更多有益的内生菌群，作为石斛药用活性成分筛选的重要来源以及丰富菌种资源库［20，25］。