微生物菌剂对设施辣椒秸秆原位堆肥土壤理化性质及细菌群落的影响

李雪菲 靳 拓 张 凯 严昌荣 丁超武 刘 勤*

(1.中国农业科学院 农业环境与可持续发展研究所， 北京 100081；2.农业农村部农膜污染防控重点实验室， 北京 100081；3.农业农村部农业生态与资源保护总站，北京 100125；4.山东省农业生态与资源保护总站， 济南 250131；5.山东成聚农业科技有限公司， 潍坊 262700)

设施农业的迅速发展同时产生了大量的农作物废弃秸秆[1]。据统计全球每年约产生秸秆70亿 t，我国每年产生秸秆超过10亿 t。秸秆贮存时间短、运输困难，在全国各地分布范围广，产出量大，进行系统回收和技术处理存在很大的难度[2]。“十三五” 期间提出秸秆综合利用率要达到85%以上的目标，秸秆综合利用技术得到迅速发展。但目前仍存在禁烧时段内时有焚烧、禁烧时段外大量集中焚烧的现象[3-4]。蔬菜秸秆中含有大量N、P、K和微量元素，富含营养物质和能量，将秸秆废弃物发酵，经过技术处理后能成为很好的有机肥料，增加土壤肥力，促进农业绿色发展[5-7]。

堆肥技术是提高资源利用率、处理农业废弃物的有效手段[8]。发酵堆肥是农业废物被腐殖化的过程，在发酵升温过程中杀死病原菌，促进有机物的腐熟[9]。有机物分解时，不仅生成含氮、磷、钾的化合物，而且还生成重要的活性物质腐殖质[10]。蔬菜秸秆所含养分大多为蔬菜作物生长所需，参与堆肥后容易被吸收利用。我国农村经常将蔬菜秸秆进行堆料处理，然而，不添加任何辅料的自然堆肥材料配比不合理，发酵周期长，木质素分解不充分，还存在较严重的氮素流失，影响堆肥的质量，达不到无害化标准[11-12]。研究表明，秸秆堆肥前添加微生物菌剂可以加速堆肥升温，提高产品成熟质量[13-15]。添加微生物菌剂可以加速农业废弃物的降解，而且操作便捷，不会造成二次污染。微生物菌剂的应用对提高堆肥效率，改善农作物品质，发展绿色无公害农业具有重要意义[16]。

目前，国内工厂化堆肥发酵技术已经非常成熟，其相应的微生物菌剂研究也已有众多优良菌群，然而，工厂化堆肥所需成本高，条件严格，技术需求高，不适合农户小规模农业生产。研究耕层原位高效发酵秸秆对发展轻简化秸秆还田技术具有重要意义。实现原位堆肥，要求农业废弃物达到绿色循环利用标准。茄果类蔬菜生产普遍使用覆膜栽培。地膜具有增加地温、抑制地表水分蒸发、抑制和消灭有害杂草等多方面功能[17-20]。2020年国内地膜覆盖种植面积超过2 000万hm2[21]。然而塑料地膜无法自然降解，回收率低，残膜给秸秆还田工作造成负担[22]。设施蔬菜生产时，利用生物降解地膜代替塑料地膜可有效解决残膜污染和废弃物难回收等问题[23-24]。生物降解地膜配合秸秆还田后进行堆肥，是一种低成本高效率的农业秸秆可持续利用技术[25-28]。与密闭好氧堆肥或厌氧发酵方式处理蔬菜秸秆比，原位堆肥不需要前期建设，并且可以避免秸秆收集运输等环节的人力及经济投入[29]。目前茄果类秸秆原位堆肥的研究尚少，特别是针对生物降解地膜覆盖条件下，对堆肥各个阶段细菌群落动态变化了解不深。因此，本研究选择设施大棚生物降解地膜覆盖下辣椒秸秆作为研究对象，通过在堆肥前添加不同剂量微生物菌剂，利用实验室常规化学分析和16 s rDNA高通量测序技术分析方法，探明外源微生物菌剂添加对原位堆肥过程中的理化指标、土壤细菌优势群落和群落结构多样性的影响，确定最适微生物菌剂添加量，为解决设施大棚农业生产中废弃秸秆资源化问题提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验设置在山东省寿光市马家旗村。该地属暖温带大陆性季风气候，夏季高温高湿，冬季干冷，年平均气温13.2 ℃，无霜期195 d，年平均降水量为708 mm，主要发生在6—8月。土壤类型为潮土，母质为密河冲积物。

1.2 试验材料

原位堆肥所用干鸡粪购于当地一家农场。辣椒秸秆从设施大棚前茬辣椒收获后直接粉碎还田，覆盖种植所用生物降解地膜主要材料为PBAT(聚对苯二甲酸-己二酸丁二醇酯)。利用秸秆粉碎还田机将秸秆粉碎后长度3～5 cm。辣椒秸秆还田量为10 000 kg/hm2。施用4 500 kg/hm2鸡粪，旋耕30 cm 耕层土壤。灌水控制耕层含水量60%左右。堆肥原料的基本理化性质见表1。微生物菌剂由山东成聚农业科技有限公司提供，菌剂呈粉末状，有效活菌数为每克10亿个，主要成分为枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌。

表1 堆肥原料的基本理化性质Table 1 The physicochemical properties of composting material

1.3 试验设计

试验温室大棚内进行。试验设5组处理，包括不添加秸秆和微生物菌剂(CT1)、不添加微生物菌剂(CT2)、150 kg/hm2微生物菌剂处理(CP1)、300 kg/hm2微生物菌剂处理(CP3)以及450 kg/hm2微生物菌剂处理(CP3)。每个处理设3个重复。供试大棚长200 m，宽3.3 m，脊高5 m。每组处理地块长20 cm，宽3.3 m，前后设置保护行，各处理用田埂隔开。为确保样品的代表性，在第1、4、10、21、31和51天采用随机取样法取样。选择堆肥发热阶段、高温阶段、降温阶段、腐熟阶段4 个时期，收集土壤待提取DNA，进行微生物细菌相对丰度和微生物群落分析。

1.4 研究方法

1.4.1理化性质分析

使用IEDA-T3型环境温度检测仪(中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所)，将探针埋入耕层土壤深分别为5、15 和25 cm，每隔24 h测定1次，选择上午10：00土壤温度数据绘制温度曲线。采用包世德[30]的方法对土壤的理化性质进行分析。样品的pH和EC值,pH用pH计测定。总有机碳(TOC)含量用重铬酸钾法测定，总氮(TN)含量用凯氏定氮法测定。

1.4.2土壤DNA提取及PCR扩增

每个样品取0.5 g土样采用土壤DNA分离试剂盒提取土壤微生物基因组DNA，完成抽提后，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的质量和浓度。以提取的基因组DNA为模板，用引物序列338F和806R扩增细菌16S rDNA基因的高变区V3-V4[31]。

1.4.3测序分析

基因组DNA由北京奥维森基因科技有限公司完成Mi Seq高通量测序，对获得的数据通过序列拼接、过滤和去嵌合体得到优化序列，进行OTU(Operational Taxonomic Units)聚类及各分类水平注释[32]。

1.4.4统计分析

采用QIIME软件计算每个土壤样本中细菌群落的α多样性值。采用R软件中的加权UniFrac距离对数据进行热图聚类和PCA分析。采用SPSS 19.0软件中的单因素方差分析ANOVA和主成分分析，方差分析多重比较采用最小显著差异(LSD)法，在P<0.05水平下检验差异显著性。

2 结果与分析

2.1 微生物菌剂投入量对农田土壤温度的影响

堆肥期间土壤最高温度及持续时间可以反映堆肥系统中微生物的活跃能力，取耕层土壤深5 cm，15 cm和25 cm处温度平均值为土壤温度，结果见图1。可知土壤温度变化可将堆肥过程分为4个阶段，分别为升温期、高温期、降温期和腐熟期。堆肥期间产生2个温度峰值，分为氧气充足(堆肥第0～30天)和氧气不足(堆肥第31～51天)2个阶段。堆肥初期土壤温度迅速上升，在堆肥第22 天左右，所有处理土壤温度达到峰值，后下降至33 ℃左右；在第30天由于棚内氧气不足，厌氧菌迅速增加，温度回升，第31～41天达到第二个高峰期，后迅速下降，在堆肥腐熟期稳定在31 ℃左右。从地温的变化可以看，堆肥过程中，CP1、CP2和CP33 组处理地温都较CT1和CT2高，其中CP3处理的地温在5组处理中最高，CT1最低。堆肥全过程CP1，CP2和CP3的最高温度比CT2分别高2.00、1.95和0.24 ℃；CT2最高温度比CT1高0.87 ℃。由于试验在设施大棚中进行，土温受天气条件影响，阴雨天气土温偏低，因此堆肥期间温度有所起伏，高温期比较短暂。

CT1，不添加秸秆和微生物菌剂；CT2，不添加微生物菌剂；CP1，150 kg/hm2微生物菌剂处理；CP2，300 kg/hm2微生物菌剂处理；CP3，450 kg/hm2微生物菌剂处理。下同。CT1, without straw and microbial agents; CT2, without microbial agents; CP1, 150 kg/hm2 microbial agent treatment; CP2, 300 kg/hm2 microbial agent treatment; CP3, 450 kg/hm2 microbial agent treatment. The same below.

2.2 微生物菌剂投入量对土壤理化性质的影响

堆肥期耕层土壤pH和EC的变化见图2。由图2(a)可知：堆肥期间所有处理堆肥初期pH为弱碱性，堆肥升温期小幅上升，堆肥高温期维持在8.5～9.0，在堆肥中期逐渐下降，腐熟期达到最低；堆肥结束时所有处理pH呈中性，其中CT1显著低于其他处理(P<0.05)。由图2(b)可知：堆肥升温期和降温期各处理EC值在0.5 ms/cm左右波动，在堆肥降温期迅速上升，在堆肥终点达到峰值。堆肥第31天各处理无显著性差异，但堆肥终点各处理存在显著差异，CP2和CP3的EC值显著高于其他3组处理；与堆肥前比较，CT1，CT2，CP1，CP2和CP3分别提高了1.22、1.55、1.25、1.37和1.86 ms/cm。五组处理在堆肥后的EC都低于2.5 ms/cm，符合无害化标准。微生物菌剂提高堆肥电导率，微生物菌剂添加量与EC值成正比。

图2 堆肥期耕层土壤pH(a)和电导率(b)的变化特点Fig.2 Characteristics of pH (a) and EC (b) in the topsoil during in-situ composting

堆肥期耕层总有机碳(TOC)和总氮(TN)的变化见图3。CP2、CP3和CT1处理组的有机碳含量降低最为显著。在整个堆肥过程中，CT1、CT2、CP1、CP2和CP3组的总有机碳含量分别下降了63.0%、41.5%、39.1%、39.1%和40.6%。CT1中有机碳含量下降幅度最大，其次是CT2、CP3。堆肥终点的TOC含量各处理没有显著差异(P<0.05)，说明微生物菌剂的添加对总有机碳的分解没有影响。

由图3(b)可知，堆肥初期，CP2的TN含略有下降，其他处理的TN含量均提高，于堆肥第11天到达第一个峰值。第11 天后，各处理的TN含量开始下降，到堆肥中期又回升，在堆肥第31天左右达到第二个峰值。第31 天后TN小幅平稳下降，到堆肥终点达到稳定。五组处理堆肥腐熟时TN含量与堆肥前相比均有所提高，CT1、CT2、CP1、CP2和CP3组的总氮含量在腐熟期无显著性差异，但在堆肥中期总氮消耗量，添加微生物菌剂的处理显著高于对照(P<0.05)。

图3 堆肥期耕层总有机碳(TOC)(a)和总氮(TN)(b)的变化特点Fig.3 Characteristics of TOC (a) and TN (b) in the topsoil during in-situ composting

2.3 微生物菌剂投入量对土壤微生物的影响

2.2.1门水平上的主要细菌分布

不同菌剂添加量处理下不同典型发酵阶段在门水平上的细菌群落结构如图4所示。可见：辣椒秸秆堆肥期间在门水平上的相对丰度超过1%的细菌种类有变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌(Firmicutes)、酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)和异常球菌-栖热菌门(Deinococcus-Thermus)。不同发酵阶段细菌优势菌群和含量存在显著差异(P<0.05)。堆肥升温期变形菌门(42.8%～44.3%)，其次是厚壁菌门(15.4%～25.0%)。高温期厚壁菌门(22.9%～61.8%)，绿弯菌门(9.5%～45.2%)和变形菌门(12.2%～21.0%)为优势菌群。降温期绿弯菌门(23.1%～66.8%)和变形菌门(11.2%～29.8%)成为优势菌群。腐熟期变形菌门(29.9%～31.7%)，绿弯菌门(16.1%～20.1%)和芽单胞菌门(13.8%～17.6%)相对丰度最高。

变形菌门数量在堆肥升温期最高，高温期迅速降低，五组处理数量最低时与堆肥前比降低了71.9%、58.7%、74.5%、76.9%和55.4%，降低幅度CP2>CP1>CT1>CT2>CP3，堆肥中后期逐渐数量回升。微生物菌剂对辣椒秸秆原位堆肥高温期变形菌门数量有显著影响，在添加300 kg/hm2处理中变形菌门数量降低最多。添加微生物菌剂的CP1，CP2和CP33组处理，在堆肥高温期厚壁菌门与堆肥前相比相对丰度显著增高，分别提高了 1.66、2.68、1.56倍。绿弯菌门在堆肥中后期的数量最多，不同处理的峰值时期存在差异。CT1在堆肥高温期绿弯菌门占比最多，占45.16%。其他4组处理在堆肥降温期绿弯菌门占比最多，CT2、CP1、CP2、CP3分别占全部细菌的23.09%、36.32%、66.84%、29.04%，可知绿弯菌门在CP2处理中作用最显著。

2.2.2属水平上的主要细菌分布

不同菌剂添加量处理下不同典型发酵阶段在属水平上的细菌群落结构如图5所示。可知：辣椒秸秆堆肥期间在属水平上的相对丰度超过1%的细菌种类有克雷伯氏菌属(Klebsiella)，芽孢杆菌属(Bacillus)，不动杆菌属(Acinetobacter)和假单孢菌属(Pseudomonas)。不同发酵阶段细菌优势菌群和含量存在显著差异。堆肥升温期优势细菌为克雷伯氏菌属(6.1%～14.2%)；高温期为不动杆菌属(0.9%～7.0%)，降温期为绿弯菌属(1.0%～3.1%)，腐熟期为芽单胞菌属(2.5%～4.0%)。

图5 堆肥不同时期土壤属水平主要细菌分布Fig.5 Distribution of main bacteria at genes level in different composting periods

噬冷杆菌属(Psychrobacter)在升温期存在少量，随着堆肥温度升高几乎消失。假单胞菌属在堆肥升温期最高，高温期迅速降低，五组处理数量最低时与堆肥前比降低了1.5%、5.0%、6.3%、7.6%、3.9%，CP2处理假单胞菌属降低幅度最大。不动杆菌属在各处理腐熟期丰度无显著差异，但是在堆肥高温期，添加微生物菌剂的处理下降更快，五组处理在高温期分别下降了-3.5%、1.4%、8.3%、4.7%、8.9%。

2.2.3细菌科水平样本聚类分析

由图6可知，不同堆肥发酵时期的细菌相对丰度在科水平上明显分离，升温期与其他三个时期细菌组成差异最大。在堆肥降温期，CT1和CT2两种处理与堆肥腐熟期的细菌聚类分布更接近， CP2、CP3两组处理细菌组成上堆肥降温期和高温期的细菌分布更接近。添加微生物菌剂的处理在降温期的厌氧绳菌科(Anaerolineaceae)丰度最高，降温期添加300 kg/hm2处理的厌氧菌在所有处理中最高。由于微生物菌剂的主要成分是芽孢杆菌，因此在同一发酵时期添加微生物菌剂的处理芽孢杆菌科(Bacillaceae)显著高于对照(P<0.05)，芽孢杆菌科含量与微生物菌剂添加量成正比。

图6 堆肥不同时期科水平细菌群落的相对丰度Fig.6 Relative abundance of the bacterial communities at the family level at different composting periods

2.2.4PCA主成分分析

评价微生物群落之间差异的PCA主成分分析结果见图5。可知：堆肥升温期所有处理聚在一组，其中CP1、CP2和CP3距离接近，CT2最远。堆肥高温期所有处理聚在一组，其中CP2相对CT1和CT2最远。堆肥降温期和堆肥腐熟期所有处理聚在一组，其中堆肥降温期CP2相对其他处理最远，堆肥腐熟期各处理没有显著差异。对于堆肥过程的细菌，同一处理下不同发酵阶段的细菌组成存在显著差异，不同处理下同一发酵阶段细菌组成结构类似。微生物菌剂对细菌群落结构的影响主要体现在在堆肥升温期和降温期，其中添加300 kg/hm2微生物菌剂的处理对细菌群落的影响最显著。

3 讨 论

微生物菌剂投入能提高堆肥土壤高温期温度峰值，与龚建英等[33]研究一致。本研究得出添加300 kg/hm2和450 kg/hm2微生物菌剂处理对提高堆肥升温期土壤最高温度效果更显著(P<0.05)。已有研究表明添加微生物菌剂能够提高堆肥土壤的pH，pH主要通过影响微生物的活性来影响堆肥过程[34]。大多数微生物生长的最优pH范围在6.7～9.0内，也是堆肥物料发酵适宜的范围[35]。pH大小不仅影响有机物质分解及微生物活动强度，而且直接影响酶参与的生化反应速度[36]。本试验样品在堆肥前都呈现弱碱性，然而，随着堆肥材料的分解和成熟以及腐殖酸的产生，pH逐渐降低并趋于稳定。在堆肥期结束时所有处理pH为6.8～7.2，适合辣椒生长。细菌丰度与土壤有机碳、氮含量有关[37]。土壤中绝大多数的微生物，依赖于分解土壤有机质来获取能量[38]。由图3(a)曲线可知，堆肥升温期所有处理组的TOC含量迅速降低，分析原因为土壤存在大量的活性嗜热微生物，堆肥初期有机碳被好氧微生物降解及同化，生成相对稳定的腐殖质[39]。堆肥中氮元素的转移是衡量堆肥质量的重要方式。氮素损失不仅会使堆肥养分散失，产生的气体还会污染环境[40]。堆肥腐熟时TN含量与堆肥前有所增加，是因为微生物菌剂中存在氨化细菌，可以有效控制氮素的损失，减少氨气挥发，起到固氮保肥的作用[41]。微生物菌剂有助于辣椒秸秆堆肥过程中氮素的保持，但不同添加量对氮素保持的效果无显著差异。

图7 PCA主成分分析Fig.7 PCA principal component analysis

微生物菌剂对细菌群落结构的影响主要体现在在堆肥升温期和降温期。微生物菌剂能够显著增加高温期厚壁菌门，加快消耗变形菌；增加降温期厌氧菌门(Anaerolineales)和芽孢杆菌门(Bacillales)丰度。各优势菌群在堆肥不同时期起到不同作用。变形菌与C、N代谢有关，可加速堆肥过程中有机物的降解[42]。微生物菌剂对辣椒秸秆原位堆肥高温期变形菌相对丰度有显著影响，在添加300 kg/hm2处理中变形菌相对丰度降低最多。厚壁菌门有很多能够抑制作物病害的细菌，例如芽孢杆菌[43-44]。芽孢杆菌能生产大量抗生素，为作物生长提供需要的营养。添加微生物菌剂的处理增加了土壤中芽孢杆菌的数量。绿弯菌主要参与大气CO2的固定和纤维素的分解，同时参与氮的硝化作用[45]。绿弯菌门在堆肥中后期的数量最多，不同处理的峰值时期存在差异，在CP2处理中发挥最显著的作用。本试验以鸡粪为原料，堆体拟杆菌门丰度较高，与赵彬涵等[46]研究一致。

4 结 论

本研究通过添加不同剂量微生物菌剂对设施大棚辣椒秸秆进行原位堆肥，测定堆肥期间耕层土壤理化性质，并使用16 s rDNA 高通量测序技术对堆肥过程四个典型发酵阶段中的细菌多样性进行了分析，结论如下：

在辣椒秸秆耕层堆肥试验中添加外源微生物菌剂提高了堆肥期间耕层土壤温度，提高了土壤可溶性盐的含量，促进了总氮(TN)的固定，有效减少氮素损失，保证了堆肥的质量。变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)和异常球菌-栖热菌门(Deinococcus-Thermus)是辣椒秸秆耕层堆肥过程在门水平上的优势细菌。克雷伯氏菌属(Klebsiella)，芽孢杆菌属(Bacillus)，不动杆菌属(Acinetobacter)和假单孢菌属(Pseudomonas)是属水平优势细菌。微生物菌剂对细菌群落结构的影响主要体现在在堆肥升温期和降温期。微生物菌剂能够显著高温期厚壁菌，大量消耗变形菌；增加降温期厌氧菌(Anaerolineales)和芽孢杆菌(Bacillales)丰度。

CP2处理堆肥最高温度与对照提高1.95 ℃，和堆肥前相比提高了1.37 ms/cm电导率和24.1%总氮，变形菌门和厚壁菌门变化在所有组内最显著，对细菌群落的影响最显著。300 kg/hm2微生物菌剂为辣椒秸秆耕层堆肥最适添加量。