苓桂术甘汤运化并举干预β淀粉样蛋白代谢研究思路刍议

王莉兰,周春祥,2

(1.南京中医药大学中医学院·中西医结合学院,江苏 南京 210023;2.南京明基医院中医部,江苏 南京 210019)

β淀粉样蛋白(β-Amyloid,Aβ)沉积是阿尔兹海默病 (Alzheimer's disease,AD) 的核心病理事件,通过其神经毒性作用参与AD进展[1]。通常,脑内过多的Aβ主要通过自噬-溶酶体系统、星形胶质细胞(Astrocytes,AS)分泌的蛋白酶和小胶质细胞(Microglia,MG)吞噬作用进行降解清除,还可通过血脑屏障(Blood brain barrier,BBB)和/或脑淋巴引流系统转运排出[2]。降解和转运途径的结构或功能异常,可引起Aβ沉积继而诱发炎症反应,最终形成“Aβ转运与降解障碍-Aβ沉积-炎症”的恶性循环。研究证实脑膜淋巴功能障碍与小鼠和人类小胶质细胞激活有关[3],小胶质细胞激活是神经炎症发生的必要过程;免疫细胞亚型CD4+Th17和 Th1淋巴细胞会分泌独特的效应细胞因子(如IL-17、IFN-γ等),这些细胞因子可能会诱导BBB出现功能障碍[4],同时炎症也会影响到自噬及星形胶质细胞的内吞作用[5-6]。

“Aβ沉积-炎症-脾虚饮停-温脾化饮”之间具有明确的逻辑关系[7],Aβ沉积可能是AD脾虚饮停的证候实质之一。同时,脾主运化功能酷似Aβ在脑内转运与降解的过程,脾运失健则会使得Aβ清除障碍。温脾化饮代表方苓桂术甘汤已被证实可显著抑制由Aβ沉积引起的神经炎症[8],课题组前期研究还证实了苓桂术甘汤可通过调节血脑屏障和类淋巴系统促进Aβ清除,并可干预影响Aβ的转运和降解的相关蛋白或靶标[9-11]。基于上述研究,我们提出如下假说:苓桂术甘汤不仅可通过降低神经炎症反应影响Aβ的转运和降解过程,还可能直接干预Aβ转运与降解途径,减少Aβ沉积,起到“运化并举”防治AD的作用(图1)。

图1 苓桂术甘汤“运化并举”防治AD示意图

本文对Aβ转运及降解途径及机制进行概述,并分析苓桂术甘汤干预Aβ转运与降解途径的研究现状,探讨该方“运化并举”防治AD的可行性,充实“脾主运化”的科学内涵,为AD防治提供新思路。

1 脑内Aβ代谢途径及机制概述

脑内过多的Aβ依靠降解和转运系统实现清除：①通过自噬-溶酶体系统、AS分泌的蛋白酶、MG吞噬作用进行降解；②通过血脑屏障和/或脑淋巴引流系统转运排出。如图2所示，Aβ可能通过自噬、星形胶质细胞、小胶质细胞实现降解;并可能通过BBB转运至血液,此过程依附于LRP1,P-gp和RAGE等相关转运蛋白,血液中的Aβ将会进入肝肾系统进行清除;Aβ可能通过脑淋巴引流系统转运至脑脊液,并转运至颈部淋巴管实现清除,其中AQP-4对Aβ的引流至关重要。上述途径的结构或功能异常会导致Aβ聚集体沉积，一方面诱发脑内大量老年斑形成，直接作用于神经元，产生毒性作用；另一方面激活脑内的AS、MG，产生炎症因子并诱导神经系统发生慢性炎症反应，激活的MG在AD病程早期即可吞噬突触，造成神经损伤[12]。维持Aβ转运与降解系统的正常功能，减少Aβ沉积能够很大程度上改善AD的病理。

图2 Aβ的降解及转运途径示意图[13]

1.1 脑内Aβ降解途径及机制概述

MG的吞噬作用和AS分泌的蛋白酶是Aβ实现降解清除的主要途径之一。AD早期,MG激活会增强其趋化、吞噬能力,增加Aβ清除,进而对神经元发挥保护作用。其中,Aβ的清除很大程度上依赖于脑内MG的吞噬作用,MG在被Aβ激活之后可以起到吞噬Aβ聚集物和坏死神经细胞的作用,以实现聚集Aβ的清除[14]。而在AD进展期,大量Aβ聚集体沉积能异常激活MG,通过释放炎症介质损害神经元、参与补体蛋白C1q介导的突触丢失、增强tau蛋白磷酸化而加剧神经元破坏[15]。可见AD不同病理阶段,MG有着不同的功能,对其实施精准调控显得尤为重要。而AS激活后会表达外排转运蛋白LRP1、Aβ流入转运蛋白晚期糖基化终产物受体(Receptor for advanced glycation end products,RAGE)、膜相关蛋白聚糖等受体以识别并结合Aβ,随后通过多种降解酶介导Aβ的清除,如胰岛素降解酶、脑啡肽酶和基质金属蛋白酶-2/-9(Matrix metallo proteinase,MMP-2/-9)[16-17]。

越来越多的证据表明自噬-溶酶体途径能够清除Aβ[18]。正常情况下,Aβ肽被β-分泌酶从淀粉样前体蛋白上切割下来产生膜连接末端片段CTFβ,这些物质通过特定的信号基序被递送至溶酶体内,并经由自噬小体进行降解,以维持适当的蛋白质水平并避免其积累的有害影响[19]。AD病理进程中,该系统的功能障碍往往先于Aβ沉积物的积聚,表现为自噬小体成熟缺陷并在神经元内堆积,自噬小体和溶酶体区室之间的融合步骤被破坏,自噬途径受损,最终导致Aβ大量聚集,成为神经元中主要的细胞内毒肽[20],维稳自噬-溶酶体系统对实现Aβ的清除至关重要。自噬相关基因(Autophagy related genes,ATGs)在自噬过程中发挥重要作用,轻链蛋白3(LC3/ATG8)能在ATG4作用下与磷脂酰乙醇胺结合,从非活性形式的LC3Ⅰ转化为活性形式的LC3Ⅱ,这一过程是自噬小体形成的关键步骤,LC3Ⅱ也被认为是自噬的标志性蛋白[21]。

1.2 脑内Aβ转运途径及机制概述

研究表明,脑淋巴引流系统是脑细胞间隙Aβ清除的重要模式[22]。以类淋巴系统和脑膜淋巴管为核心的脑淋巴引流系统实现了中枢神经系统内Aβ的高效率清除,脑脊液-间质液交换后流经间质时会将其中的细胞外Aβ通过静脉旁通路引流至脑膜淋巴管,再流向颈部淋巴管实现清除[23]。作为类淋巴系统的重要结构,水通道蛋白-4(Aquaporin-4,AQP-4)对Aβ的引流至关重要,AQP-4的表达水平是影响类淋巴系统引流Aβ的重要因素,脑脊液随着动脉搏动在AQP-4的作用下从动脉周围间隙进入脑细胞外间隙,AQP-4缺失及极性分布紊乱可导致Aβ清除减少,促进AD的形成与发展[24]。大多数AQP-4存在于星形胶质细胞末端,由于其特殊的定位,AQP-4将星形胶质细胞的细胞质与间质液连接起来,从而产生与全身组织水动力学不同的动态流体,从而促进间质运动,这对于类淋巴引流至关重要[25]。

脑内Aβ经BBB转运占中枢神经系统Aβ总清除率的四分之一[26]。BBB功能障碍和Aβ沉积之间存在恶性循环,一项最近的研究观察到AD患者大脑结构中紧密联结破坏、BBB通透性增加以及转运蛋白表达水平降低,这些发现表明Aβ可能是破坏BBB完整性和紧密联结的最初原因,当BBB功能障碍又会难以进行Aβ的正常转运[27]。可见,BBB转运Aβ主要取决于两个因素:Aβ转运蛋白和BBB完整性。Aβ转运蛋白包括LRP1、P-糖蛋白1和RAGE[28];此外,在脑组织中,MMP-2/-9是造成BBB完整性受到损害的主要因素之一,脑缺血小鼠再灌注期间的MMP-2/-9活性增加,血脑屏障也具有更高的通透性[29]。

需要明确的是,Aβ的降解和转运系统并非完全独立的,两者存在相互关联和影响的现象。如自噬与BBB有着密切联系,大脑皮层和海马中BBB的自噬相关PI3K/Akt/mTOR信号通路以年龄依赖性方式被调低,从而促进AS的转移并诱导自噬[30]。

2 脾主运化与Aβ代谢关联分析

《素问·经脉别论篇》:“饮入于胃,游溢精气,上输于脾,脾气散精,上归于肺,通调水道,下输膀胱,水精四布,五经并行。”该条文形象阐释了脾主运化的过程,脾通过“运化”不仅能消化、吸收饮食中的精微物质,更可消除、排出体内的糟粕。具体而言,脾以“化”将胃纳入的水饮、谷物消化为人体所需精微物质,脾以“运”将体内精微转输至五脏六腑,并能参与体内多余糟粕的排泄,如痰、饮、水湿等病理产物。“运”和“化”相辅相成,实现人体正常的精微物质代谢,如若脾运功能障碍,脾不足以吸收人体精微,将精微运输至脏腑或排除多余糟粕更是困难。

从上文可知,Aβ通过降解和转运实现清除属人体正常的生理活动,从中医取象比类的角度来看,脾之“运化”过程酷似Aβ在体内的降解与转运的过程,其中通过自噬-溶酶体系统、AS分泌的蛋白酶、MG吞噬作用降解神经元内积聚的Aβ过程属于脾主“化”的内容;通过脑淋巴引流系统、BBB转运Aβ至颈外淋巴、血浆的过程属于脾主“运”的范畴(图3)。细推其理,整体观念是中医哲学观的基础,人为整体,脏腑经络各司其职;中枢神经系统亦属独立整体,神经元、蛋白酶、屏障结构等各守其位。随着现代医学精密性的延展,可直接观测到脏腑与微细结构之间的关联,譬如前文提到Aβ沉积可能是AD脾虚饮停的证候实质之一。引而伸之,脾之运化功能维持人体精微正常输布的作用可关联到Aβ的代谢。脾之运化功能正常,Aβ的降解和转运功能不易失调;脾之运化功能障碍,可能会导致Aβ的代谢异常,换言之Aβ的降解和转运功能异常时可从脾失运化的角度进行论治。

图3 脾“运化”Aβ的取象比类示意图

3 苓桂术甘汤“运化并举”干预Aβ代谢的基础探析

脾主运化功能参与Aβ代谢,脾运健旺则可维持Aβ的正常转运与降解,当脾主运化功能受损,Aβ在体内的转运与降解的某一作用链条失效,则会导致Aβ代谢异常,发生沉积,进而影响AD进展。脾虚饮停是AD的重要病机[31],温脾化饮代表方苓桂术甘汤在AD相关研究中取得了长足发展,尤其在干预Aβ代谢方面颇具优势[9,11,32-34]。

3.1 苓桂术甘汤通过干预脾“化”功能参与Aβ降解

基于中医取象比类，自噬-溶酶体系统、AS分泌的蛋白酶、MG吞噬作用降解神经元内积聚的Aβ过程属于脾主“化”的内容。苓桂术甘汤能够干预上述有关脾"化"的功能参与Aβ降解，郭一等证实苓桂术甘汤能够激活细胞自噬,其主要体现在可升高自噬相关基因ATG5表达量及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值[34],一项最新的研究发现苓桂术甘汤还能够调节自噬相关基因ATG3[35]。苓桂术甘汤的组成药物中多种主要成分可发挥调节自噬的作用,如甘草酸和茯苓酸[36-37]。

苓桂术甘汤可调节AS激活后表达的RAGE、LRP1受体[9],还能影响小鼠急性心肌损伤时MMP-2/-9的表达,MMP-9是参与Aβ清除的重要降解酶,我们有理由认为苓桂术甘汤可通过调节RAGE、LRP1、MMP-9的表达促进AS与更多的受体结合或分泌相关蛋白酶促进Aβ清除,当然这仍需进一步的试验证实。本课题组还证实了苓桂术甘汤能够抑制MG产生的促炎细胞因子水平,减轻Aβ沉积诱发的炎症反应[9]。另有研究发现,甘草有效成分在AD中具有稳定MG的作用,具体表现为异甘草素抑制激活小胶质细胞ERK1/2活性和促炎因子[38],甘草素则可以通过调节小胶质细胞的M1/M2转化来降低Aβ水平[39],从而改善AD小鼠的突触可塑性下降、tau蛋白过度磷酸化和记忆缺陷的行为学表现。

3.2 苓桂术甘汤通过干预脾“运”功能参与Aβ转运

此外，脑淋巴引流系统、BBB转运Aβ至颈外淋巴、血浆的过程属于脾主“运”的范畴。苓桂术甘汤能够干预上述有关脾“运”的功能参与Aβ转运，该方干预类淋巴引流调控Aβ转运已得到中医理论和实验研究支持,如宁晚玲等详细阐发了脾虚致脾主运化水液功能异常时介导水跨膜转输的AQP-4功能状态的改变[40];苓桂术甘汤及其合方还可调节胸腔积液模型大鼠小肠上段AQP-4和其他消化道水通道蛋白表达[41-42]。在AD中,苓桂术甘汤可能通过调控炎症以及Aβ转运影响脑淋巴引流途径,改善脑部微环境[31],进一步实验表明该方通过降低AQP-4相关的白细胞介素-1β水平改善由脑淋巴阻断引起的皮质损伤,发挥保护神经元功能,延缓AD进展[11]。

苓桂术甘汤可通过调节血脑屏障Aβ转运蛋白促进Aβ清除,以双侧脑室注射Aβ法建立AD大鼠模型,发现苓桂术甘汤可通过调控MAPK和NF-κB信号通路抑制IL-1β、IL-6及TNF-α等炎性因子的产生,并可通过调节Aβ转运蛋白LRP-1和RAGE的表达,和促进相关骨架蛋白如跨膜密蛋白-5、外周支架蛋白-1和闭合蛋白等的表达,进而促进Aβ转运实现Aβ清除[9,43],另有学者证实了苓桂术甘汤可抑制小鼠急性心肌损伤时MMP-2/-9的过表达[44],表明苓桂术甘汤能影响MMP-2/-9的表达,而MMP-2/-9是造成BBB完整性受到损害的主要因素,苓桂术甘汤可能通过干预MMP-2/-9的表达发挥保护BBB完整性的作用。本课题组已证实苓桂术甘汤对AD体外血脑屏障损伤具有修复作用,其机制可能与抑制炎症因子和MMP-2、MMP-9表达有关[43]。

4 结语

基于上述对Aβ代谢途径及机制的认识,苓桂术甘汤可通过抗炎作用干预AD进程,结合该方具有促进AS分泌降解酶、增强MG吞噬作用、调节自噬、促进类淋巴引流、保护BBB实现Aβ清除的药理作用,我们有理由认为苓桂术甘汤能实现“运化并举”全方位干预Aβ代谢的作用,维持Aβ的产生和清除平衡,延缓AD进展。深入挖掘苓桂术甘汤“运化并举”实现Aβ转运与降解的潜在机制,有助于阐释脾主运化与脑内Aβ代谢的相互关系,进一步完善温脾化饮法治疗AD的生物学机制,也可在一定程度上揭示AD脾失运化的证候实质,为中医药防治AD提供新视角。