福建醇化烟叶仓库空气中真菌多样性研究

陈善义，李菁菁，刘景川，张瑞强，王雨晴，何 伟，简少平，詹仁锋，方 璟，龙 腾，姜振锟*

福建醇化烟叶仓库空气中真菌多样性研究

陈善义1，李菁菁1，刘景川2，张瑞强3，王雨晴4，何 伟1，简少平3，詹仁锋1，方 璟1，龙 腾1，姜振锟1*

（1.福建中烟工业有限责任公司技术中心，福建 厦门 361021；2.龙岩烟草工业有限责任公司，福建 龙岩 364021；3.厦门烟草工业有限责任公司，福建 厦门 361026；4.福州大学食品科学技术研究所，福建省食品生物技术创新工程技术研究中心，福州 350108）

为研究烟叶醇化仓库空气中真菌的多样性，选取龙岩东肖、龙岩红炭山、厦门东孚3座烟叶仓库1～5楼层的空气为研究对象，于2019年1—12月利用空气采样法对仓库各楼层空气中真菌进行月度采集、分离、鉴定。结果表明：（1）3座仓库各楼层空气中真菌的含量均呈现夏季多而其他季节少的规律，东肖、红炭山仓库空气中真菌的含量高于东孚仓库，其最高值分别是东孚仓库的10.9倍和9.4倍。（2）3座仓库空气中共分离获得835株真菌，归属于3个门、10个纲、54个属、158个种，且优势菌属为、和，菌株数量占仓库空气中分离所得总菌株数比例大于10%的菌种为、、、和。韦恩图分析结果表明，东肖、红炭山、东孚仓库空气中分离获得的真菌种类数分别为68、92、68。其中，3座仓库共有的真菌为20种，东肖、红炭山、东孚仓库特有的真菌种类数分别为26、45、37。（3）一年中，仓库空气中真菌种类在冬季相对较多，而在春末夏初相对较少。、和是仓库空气中较为稳定存在的真菌菌种。

仓储养护；空气微生物采样；真菌

片烟醇化是提高卷烟原料品质的重要手段。片烟在仓储养护过程中若保管不当（如仓库卫生条件较差、库内环境温湿度过大等）则容易发生霉变。烟叶的霉变是烟叶中真菌在适宜环境条件下大量生长和繁殖的结果[1-2]。烟叶中含有真菌生长所需的蛋白质和还原糖等多种营养物质，再加上烟叶本身吸湿性强的特性[3]，这些因素给仓储养护的片烟带来了霉变的风险。空气中存在着多种真菌[4]，片烟在仓储养护过程易沾染真菌孢子。目前，有关烟叶仓库空气中真菌多样性研究较少。姜振锟等[5]分析了仓库空气中真菌组成，而对于真菌的含量变化规律及多个地区仓库真菌区系的差异并未进行系统地研究。为此，本研究选取龙岩、厦门两地共3座烟叶仓库为研究对象，利用空气采样法对仓库空气中真菌进行采集、分离及ITS鉴定，系统研究仓库空气中真菌含量的月度变化规律及不同仓库空气中真菌的组成，旨在为片烟霉变的防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器

培养基：氯硝胺18%甘油（DG18）琼脂培养基，购自广东环凯微生物科技有限公司。按产品说明书进行配置，于121 ℃下灭菌15 min，冷却至50 ℃左右后，加入硫酸链霉素[购自梯希爱（上海）化成工业发展有限公司]，使其终浓度为50 μg/mL，以抑制细菌的生长。

其他试剂：Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒、Plus DNA聚合酶、dNTP Mixture（10 mmol/L），购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

仪器：空气微生物采样器，型号MAS-100NT，购自德国Merck公司；灭菌锅，型号VX-95，购自德国Systec公司；超净工作台，型号SW-CJ-1FD，购自苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；生化培养箱，型号BPC-500F，购自上海一恒科技有限公司。

1.2 仓库空气中真菌的采集、培养和计数

试验于2019年1—12月进行，每个月进行1次仓库空气中真菌的采集。试验地点为龙岩烟草工业有限责任公司的东肖烟叶仓库（2012年建成并投入使用，库内环境年平均温度24.7 ℃、年平均相对湿度64.2%）、红炭山烟叶仓库（1995年建成并投入使用，库内环境年平均温度19.6 ℃、年平均相对湿度64.7%）和厦门烟草工业有限责任公司的东孚烟叶仓库（2016年建成，库内环境年平均温度25.9 ℃、年平均相对湿度58.3%），每个地点各选1座，每座共5层。试验时，每个楼层重复取样3次。

仓库空气中真菌的采集方法如下：以氯硝胺18%甘油（DG18）琼脂培养基为采集培养基，将培养皿盖子打开后，迅速放入空气微生物采样器内的采样头上并固定好，盖上采样盖，设定采样体积为100 L，按仪器操作说明书进行采样。采样完成后，取下培养皿，迅速盖上培养皿盖，用Parafilm封口膜进行密封。

将所得培养皿带回实验室，置于生化培养箱中，28 ℃条件下培养3～5 d。待菌落长出后，统计各培养皿形成的菌落数，以每100 L空气采集获得的菌落数（CFU/100 L）（CFU，colony forming unit，即菌落形成单位）为单位表征仓库空气中真菌的含量，利用SPSS 18.0软件进行数据的统计及分析。

1.3 真菌的物种鉴定

于超净工作台中，挑取不同形态（菌落形状、颜色、表面状态、隆起状态、边缘形状、孢子颜色、菌丝颜色等）的单菌落，转移至新的氯硝胺18%甘油（DG18）琼脂培养基中，28 ℃下培养3～5 d。从菌落的边缘处挑取少量菌丝，转移至新培养基中，重复3次上述操作进行纯化。

采用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒提取样品基因组DNA。PCR所用引物为ITS1-F（5′- TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4-R（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）[6]。反应体系：2.5 μL 10×PCR Buffer（含Mg2+）、1 μL dNTP Mixture (10 mmol/L)、0.5 μLPlus DNA Polymerase（5 U/μL），10 µmol/L正、反向引物各1 µL，1 μL模板DNA，补足ddH2O至25 μL。反应条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30个循环；最后72 ℃延伸10 min。利用1.5%琼脂糖凝胶对所得扩增产物进行电泳检测。PCR产物的测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，参照张真娜等[7]的方法进行真菌物种的鉴定。

2 结 果

2.1 仓库空气中真菌含量变化

由图1可知，龙岩东肖、龙岩红炭山及厦门东孚仓库各楼层空气中真菌的含量均呈现夏季多而其他季节少的规律。龙岩东肖、龙岩红炭山仓库中真菌的含量总体上高于厦门东孚仓库，最高值分别为1176.7和1018.7 CFU/100 L，是厦门东孚仓库最高值（108.3 CFU/100 L）的10.9倍和9.4倍。

注：a，龙岩东肖仓库；b，龙岩红炭山仓库；c，厦门东孚仓库。

2.2 仓库空气中真菌的分离和鉴定

利用氯硝胺18%甘油（DG18）琼脂培养基，从3座仓库各楼层空气中共分离获得835株真菌。根据ITS鉴定结果进行归类，发现这835株真菌归属于3个门、10个纲、54个属、158个种（表1）。属于Ascomycota门的真菌有782株，所占比例为93.65%；属于Basidiomycota门的真菌有50株，所占比例为5.99%；属于Mucoromycota门的真菌有3株，所占比例为0.36%。Ascomycota门包含5个纲：Dothideomycetes、Eurotiomycetes、Leotiomycetes、Saccharomycetes和Sordariomycetes，共43个属。Basidiomycota门包含4个纲：Agaricomycetes、Exobasidiomycetes、Microbotryomycetes、Tremellomycetes，共9个属。Mucoromycota门仅有1个纲：Mucoromycetes，共2个属。

2.3 不同仓库空气中真菌的多样性比较

在属分类水平上进行不同仓库空气中真菌的多样性比较（图2），发现东肖仓库属包含的菌株数目最多，占该仓库分离获得的总菌株数的47.35%（116/245）；其次为属、属，分别占31.43%（77/245）、8.57%（21/245）。红炭山仓库属包含的菌株数目最多，占该仓库分离获得的总菌株数的34.87%（106/304）；其次为属、属，分别占30.59%（93/304）、15.46%（47/304）。东孚仓库属包含的菌株数目最多，占该仓库分离获得的总菌株数的43.36%（124/286）；其次为属、属，分别占27.27%（78/286）、9.44%（27/286）。由此可见，、、这3个属为东肖、红炭山、东孚仓库的优势菌属。

表1 仓库空气中分离获得的真菌种类数目

表1（续）

Table 1 continued

进一步在种分类水平上进行不同仓库空气中真菌的多样性比较。由图3可知，东肖仓库中，菌株数量占该仓库分离所得总菌株数量比例大于10% 的菌种为、和，所占比例分别为11.84%（29/245）、10.61%（26/245）和10.20%（25/245）；红炭山仓库中，菌株数量占该仓库分离所得总菌株数量比例大于10%的菌种为，所占比例为11.18%（34/304）；东孚仓库中，菌株数量占该仓库分离所得总菌株数量比例大于10%的菌种为、和，所占比例分别为13.29%（38/286）、12.24%（35/286）和10.14%（29/286）。

注：DX，龙岩东肖仓库；HTS，龙岩红炭山仓库；DF，厦门东孚仓库。下同。

图3 三座仓库主要真菌各种菌株数目所占比例

韦恩图可以分析不同仓库共有和特有的真菌种类。由图4可知，东肖、红炭山、东孚仓库分离获得的真菌种类数分别为68、92、68。其中，3座仓库共有的真菌有20种，东肖、红炭山、东孚仓库特有的真菌种类数分别为26、45、37。由此可见，红炭山仓库含有的真菌种类数最为丰富，且特有的真菌种类数最多。

图4 不同仓库空气真菌种类韦恩图分析

2.4 不同仓库空气中真菌的种类变化分析

由图5可知，三座仓库空气中每月分离所得真菌的种类数为7～26，其中1、2月份获得的种类数最多，而4、5、6月份获得的种类数较少。由此可见，一年中，仓库空气中真菌种类在冬季相对丰富，而在春末夏初相对单一。

图5 不同仓库空气真菌种类数月度变化

在12次的月度采样中，对3个仓库空气中出现6次及以上的真菌进行统计（表2）。结果发现，有8种真菌出现至少6次，为、、、、、、、。其中在东肖、红炭山、东孚仓库的12次月度采样中分别出现了10、11、11次。此外，和在东孚仓库的12次月度采样中分别出现了11次和10次。这说明，、和是仓库空气中较为稳定存在的真菌菌种。

表2 不同仓库空气中出现6个月及以上的真菌种类统计

3 讨 论

利用空气采样法对龙岩东肖、龙岩红炭山、厦门东孚3座仓库各楼层空气中真菌进行了采集、分离、培养及ITS鉴定，发现仓库各楼层空气中真菌的含量均呈现夏季多而其他季节少的规律，说明仓库空气中真菌在夏季繁殖迅速。这种规律在向东红[8]对川渝地区不同季节仓储片烟的真菌污染情况调查中也有发现。福建地处中国东南部，夏季高温高湿，利于真菌的生长和繁殖。因此，在片烟的仓储养护过程中，要重点做好夏季的防霉措施。比较3座仓库空气中真菌的数量发现，东孚仓库的真菌数量少于东肖和红炭山仓库，可能原因是东孚仓库年平均环境相对湿度（58.3%）低于东肖仓库（64.2%）和红炭山仓库（64.7%）。同处于龙岩市的红炭山和东肖仓库年平均环境相对湿度相差不大，尽管红炭山仓库年平均环境温度（19.6 ℃）低于东肖仓库（24.7 ℃），但韦恩图分析表明红炭山仓库空气中真菌的种类数（92种）依然大于东肖仓库（68种）。可能的原因有2个：一是使用年限较长的仓库，空气中的真菌得以更长时间的富集；二是不同来源的片烟本身含有的真菌种类不一样[9]。

本研究分离获得的54个属中，有5个属可致烟草制品发生霉变。其中、、、4个属可致醇化片烟发生霉变[8, 10-12]，属对烟叶的致霉性尚未见报道，但可致成品卷烟烟支发生霉变[13]。本研究发现，、、是醇化烟叶仓库空气中的优势菌属。可见，福建地区醇化烟叶仓库空气中的优势菌属均为致霉菌，下一步应对这些优势霉菌系统开展生物学特性及致霉条件研究，以便为片烟的防霉养护提供理论支持。

在种分类水平上，姜振锟等[5]的研究中发现菌株数量占烟叶仓库空气中分离所得总菌株数量比例大于10%的菌种为、和，是烟叶醇化仓库空气中的优势菌种。本研究发现除上述3种真菌以外，菌株数量占烟叶仓库空气中分离所得总菌株数量比例大于10%的菌种还有和，可能是本研究采集的楼层更多，时间跨度更大，因而可发现更多的优势真菌种类。

对不同月份采集获得的真菌种类数进行统计分析发现，冬季真菌种类数相对较多，而春末夏初相对较少。这可能是冬季环境温湿度相对较低，各类真菌生长和繁殖较慢，而春末夏初时，气温回升，相对湿度较大，一些种类的真菌得以快速生长和繁殖，并形成优势菌群，造成采集获得的真菌种类数相对较少。

4 结 论

结果表明，福建地区烟叶醇化仓库库内环境空气中真菌的含量夏季多，其他季节少，东肖、红炭山仓库空气中真菌的含量高于东孚仓库。烟叶醇化仓库库内环境中真菌种类丰富，3座仓库共获得835株真菌，归属于3个门、10个纲、54个属、158个种，菌株数量占仓库分离所得总菌株数量比例大于10%菌种为、、、和。一年中，仓库空气中真菌种类在冬季相对较多，而在春末夏初相对较少。、和是仓库空气中较为稳定存在的真菌种类。

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Diversity of Aerial Fungi in Tobacco Warehouse in Fujian Province

CHEN Shanyi1, LI Jingjing1, LIU Jingchuan2, ZHANG Ruiqiang3, WANG Yuqing4, HE Wei1, JIAN Shaoping3, ZHAN Renfeng1, FANG Jing1, LONG Teng1, JIANG Zhenkun1*

(1. Technology Center, China Tobacco Fujian Industrial Co., Ltd., Xiamen, Fujian 361021, China; 2. Longyan Tobacco Industrial Co., Ltd., Longyan, Fujian 364021, China; 3. Xiamen Tobacco Industrial Co., Ltd., Xiamen, Fujian 361026, China; 4. Institute of Food Science and Technology, Fuzhou University, Fujian Center of Excellence for Food Biotechnology, Fuzhou 350108, China)

To study the diversity of fungi in the air of tobacco warehouses, monthly collection, isolation and identification of fungi in the air of floors 1-5 of 3 warehouses (Dongxiao in Longyan, Hongtanshan in Longyan and Dongfu in Xiamen) were carried out with the air sampling method from January to December in 2019. The results showed that: (1) The fungal quantity in the air of each floor of the three warehouses was high in summer but low in other seasons, and the content of fungi in the air of Dongxiao and Hongtanshan warehouses were higher than that of Dongfu, with the highest value being 10.9 and 9.4 times of Dongfu, respectively. (2) A total of 835 fungal strains, belonging to 3 phyla, 10 classes, 54 genera and 158 species, were obtained from the 3 warehouses. The dominant genera were,and.,,,andwere the species that accounted for more than 10% of the total isolates number in the air of the tobacco warehouses. The results of Venn diagram analysis showed that 68, 92 and 68 species of fungi existed in the warehouses of Dongxiao, Hongtanshan and Dongfu, respectively. 20 species were common to the 3 warehouses, and the numbers of specific species for the warehouses in Dongxiao, Hongtanshan and Dongfu were 26, 45 and 37, respectively. (3) The numbers of fungal species in the air of tobacco warehouses were relatively high in winter, but relatively low in late spring and early summer over a period of one year.,andwere relatively steady fungal species in the air of tobacco warehouses.

storage and maintenance; airborne microbes sampling; fungi

10.13496/j.issn.1007-5119.2022.04.007

S435.72

A

1007-5119（2022）04-0048-07

福建中烟工业有限责任公司科技项目（FJZYKJJH2018011）

陈善义（1988-），男，农艺师，硕士，研究方向：烟草原料研究。E-mail：chensy188@126.com。*通信作者，E-mail：jzk23326@fjtic.cn

2022-02-11

2022-08-01