组织蛋白酶S对人骨肉瘤细胞增殖、迁移、侵袭的影响及其机制

纪海茹，孔令伟，曹 胜，吕家兴，李佳欣，刘春雨，金 宇

骨肉瘤作为最常见的原发性恶性骨肿瘤，常伴有突变和转移，患者预后极差。虽然化疗和手术可以让骨肉瘤患者生存率有所提高，但转移性或复发性骨肉瘤患者的存活率仍然很低，患者5年总体生存率不到20%[1]。由于肿瘤的恶性进展依赖于肿瘤相关分子的调控，因此寻找与骨肉瘤恶性表型和临床预后相关的新型标记物尤为重要。组织蛋白酶S (cathepsin S,Cat S)作为半胱氨酸蛋白酶家族的主要成员，可通过调控结缔组织和基底膜的溶解和重塑，影响机体炎症和免疫反应，并最终促进肿瘤生长[2]。近年来文献报道[3-4]，Cat S在肝细胞癌等多种癌症中高表达，并对肿瘤细胞的恶性表型例如增殖和侵袭发挥促进作用。然而，尚未有研究报道Cat S在骨肉瘤中的具体作用。该研究旨在探讨Cat S对人骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其潜在分子机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与耗材人正常成骨细胞(hFOB)和人骨肉瘤细胞(SAOS2和MG63)购自中国科学院上海细胞研究所；DMEM培养基(货号：170217083240)、10%胎牛血清(货号：SH30070.03E)、1%链霉素/青霉素(货号：SV30010)和胰蛋白酶(货号：SH30042.01)购自美国Hyclone公司；TRIzol RNA裂解液(货号：GS101-01)、RIPA蛋白裂解液(货号：T15196)和BCA蛋白定量试剂盒(货号：KL80816-500)购自北京全式金生物有限公司；Transwell小室(货号：3413)和Matrigel基质胶(货号：HYC021M01)购自美国Corning公司；Cat S特异性siRNA干扰序列(si-Cat S)和阴性对照序列(si-NC)合成自美国Qiagen公司；cDNA逆转录试剂盒和快速定量SYBR®Green RT-PCR试剂盒购自美国Sigma公司；CCK-8细胞活性检测试剂盒和LipofectamineTM2000转染试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司；一抗：Bcl-2、Bax、LRP5、β-catenin、C-myc、Cyclin D1和GAPDH购自美国Cell Signaling公司；二抗：辣根过氧化酶标记的兔抗羊IgG购自美国Abcam公司；PCR引物由上海吉玛制药技术有限公司合成；其他常见分子生物学相关试剂与耗材购自美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 将正常人成骨细胞(hFOB)和人骨肉瘤细胞(SAOS2和MG63)用含有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM完全培养基进行培养。所有细胞均放置在5%的CO2培养箱中培养，温度控制在37 °C，相对湿度为95%。细胞每3 d更换一次培养基，待细胞融合度达到80%以上时进行传代培养。取3代以后的对数期细胞用于后续实验研究。

1.2.2细胞转染与分组 将对数期的人骨肉瘤细胞SAOS2及MG63按照3×105个/孔的密度接种到6孔板中，待细胞融合度达到80%并贴壁生长时，按照LipofectamineTM2000转染试剂盒操作说明书将si-Cat S和si-NC转染至SAOS2和MG63细胞中。经过48 h的转染，采用RT-PCR检测转染效率。本研究中的实验细胞共分为4组：hFOB组(hFOB细胞)、Control组(未转染的SAOS2或MG63细胞)、si-NC组(转染了si-NC的SAOS2或MG63细胞)和si-Cat S组(转染了si-Cat S的SAOS2或MG63细胞)。siRNA-Cat S和阴性对照序列分别为5′-CTACAAAGCCACGGATGAA-3′和5′-TTCGCGACAAAACAGACGA-3′。

1.2.3CCK-8法和克隆形成实验检测人骨肉瘤细胞SAOS2和MG63的增殖活性 CCK-8实验：将转染后的SAOS2和MG63细胞按照3×103个/ml的密度接种到96孔板中，设置3个重复孔，加入DMEM完全培养基100 μl/孔。这些细胞在37 ℃和5%CO2培养箱中分别培养0、24、48和72 h后，每孔加入10 μl的CCK-8溶液继续孵育1 h。通过酶标仪检测各组细胞在450 nm波长处的光密度值。 克隆形成实验：将转染后的SAOS2和MG63细胞按照900个/孔的密度接种到6孔板中，常规培养14 d后形成自然集落。培养结束后，用磷酸盐缓冲溶液冲洗细胞3次后，在室温下用0.2%的结晶紫染色30 min。染色结束后在倒置光学显微镜下对菌落进行拍照和计数分析。

1.2.4划痕实验检测人骨肉瘤细胞SAOS2和MG63的迁移能力 将转染后的SAOS2和MG63细胞按照1×104个/孔的密度接种到24 孔板中常规培养24 h。等细胞融合度达到90%以上时，用200 μl的无菌移液管尖端垂直于孔板表面轻轻划过，然后用磷酸盐缓冲溶液冲洗划痕处3次。在倒置光学显微镜下观察创面形成后0和24 h的愈合情况，测量细胞的迁移距离并计算迁移率。

1.2.5Transwell实验检测人骨肉瘤细胞SAOS2和MG63的侵袭能力 将转染后的SAOS2和MG63细胞按照5×104个/ml的密度制成细胞悬液。将100 μl的无血清细胞悬液加入已铺好Matrigel胶的Transwell上室，下室加入600 μl的含10%胎牛血清的DMEM完全培养基。细胞在37 ℃和5%CO2的培养箱中培养24 h。培养结束后先用4%的多聚甲醛对上室细胞固定10 min后再在室温下用0.5%结晶紫染色15 min。染色后的细胞在倒置光学显微镜下拍照并计数分析。

1.2.6RT-PCR法检测人骨肉瘤细胞SAOS2和MG63中的mRNA表达 用TRIzol RNA提取液从转染后的SAOS2和MG63细胞中分离和提取全部RNA。以cDNA逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA。为了评估Cat S mRNA水平，严格按照快速定量SYBR®Green RT-PCR试剂盒操作说明进行RT-PCR检测。RT-PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性40次每次10 s，60 ℃退火延伸30 s，共计45个循环。用2-ΔΔCt方法计算Cat S的相对含量，并以GAPDH作为内参。PCR引物序列包含2部分，Cat S引物序列F:5′-GCCTGATTCTGTGGACTGG-3′，R:5′-GATGTACTGGAAAGCCGTTGT-5′；GAPDH引物序列F:5′-GGAGTCCACTGGCGTCTTC-3′，R:5′-GCTGATGATCTTGAGGCTGTTG-3′。

1.2.7Western blot法检测人骨肉瘤细胞中相关蛋白的表达 用RIPA细胞裂解液从转染后的SAOS2细胞中提取全部蛋白质样品。通过BCA蛋白定量试剂盒检测提取蛋白的浓度。蛋白变性后每孔上样量为20 μg，经12% SDS-PAGE分离后转移到PVDF膜上。用5%的脱脂奶粉封闭液对PVDF膜进行封闭2 h，然后与一抗在4 ℃下共孵育2 h。培养结束后，用TBST洗膜3次后，二抗继续孵育1 h。最后，通过增强的ECL化学发光成像系统显示蛋白条带并采用Image J软件对蛋白进行定量分析。

2 结果

2.1 Cat S在人骨肉瘤细胞SAOS2和MG63中的表达通过RT-PCR和Western blot法检测了Cat S在正常人成骨细胞(hFOB)和人骨肉瘤细胞(SAOS2和MG63)中的表达。如图1A所示，Cat S在正常细胞hFOB中的表达为低于人骨肉瘤细胞SAOS2和MG63中的蛋白表达(t=17.35,P<0.001)，差异有统计学意义。同时，如图1B所示， Western blot结果显示，三组内参GAPDH的表达相近，相比较正常细胞hFOB，Cat S在人骨肉瘤细胞SAOS2和MG63中的mRNA表达水平上调(t=17.18,P<0.001)，差异有统计学意义。上述结果提示了Cat S的异常表达可能与骨肉瘤的发生发展有关。

2.2 siRNA沉默Cat S基因对人骨肉瘤细胞SAOS2和MG63增殖活性的影响为了研究Cat S在人骨肉瘤细胞生长过程中的作用，通过siRNA干扰降低Cat S在SAOS2和MG63中的表达。如图2A所示，与si-NC组比较，si-Cat S组中Cat S的表达下调(P<0.001)。接下来，通过CCK-8和克隆形成实验检测了敲低Cat S对SAOS2和MG63细胞增殖活性的影响。如图2B所示，与si-NC组比较，si-Cat S组中SAOS2和MG63细胞的增殖活性明显降低(t=9.12,P<0.001)，差异有统计学意义。如图2C所示，与si-NC组比较，si-Cat S组中SAOS2和MG63细胞集落数目明显减少(t=9.38,P<0.001)，差异有统计学意义。以上结果显示，敲低Cat S能有效抑制SAOS2和MG63细胞的增殖活性。

2.3 siRNA沉默Cat S基因对人骨肉瘤细胞SAOS2和MG63迁移和侵袭能力的影响通过划痕实验和Transwell实验检测敲低Cat S对SAOS2和MG63细胞迁移和侵袭能力的影响。如图3A所示，与si-NC组比较，si-Cat S组中SAOS2和MG63细胞的迁移能力受到抑制，差异有统计学意义(F=16.52,P<0.001)。如图3B所示，与si-NC组比较，si-Cat S组中SAOS2和MG63细胞的侵袭能力受到抑制，差异有统计学意义(F=12.19,P<0.001)。

图1 Cat S蛋白在正常人成骨细胞hFOB和人骨肉瘤细胞SAOS2及MG63中的表达水平

图2 siRNA沉默Cat S基因对人骨肉瘤细胞SAOS2和MG63增殖活性的影响

图3 siRNA沉默Cat S基因对人骨肉瘤细胞SAOS2和MG63迁移和侵袭能力的影响

2.4 siRNA沉默Cat S基因对骨肉瘤SAOS2细胞凋亡的影响Western blot实验用于检测敲低Cat S对SAOS2细胞凋亡的影响。如图4所示，与si-NC组比较，si-Cat S组抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调，而促进促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表达上调(t=9.12,P<0.001)，差异有统计学意义。以上结果显示，敲低Cat S能诱导SAOS2和MG63细胞凋亡。

图4 siRNA沉默Cat S基因对骨肉瘤SAOS2细胞凋亡的影响

2.5 siRNA沉默Cat S基因对骨肉瘤SAOS2细胞Wnt/β-catenin通路相关蛋白表达的影响Western blot实验检测了Cat S对人骨肉瘤细胞Wnt/β-catenin通路的调控作用。如图5所示，与si-NC组比较，si-Cat S组细胞中Wnt/β-catenin通路相关蛋白LRP5、β-catenin、C-myc和Cyclin D1的表达下调(t=17.32,P<0.001)，差异有统计学意义。综合上述结果表明，Cat S能在人骨肉瘤细胞中发挥促癌作用加剧癌细胞的生长，其机制可能与Wnt/β-catenin通路的激活有关。

图5 siRNA沉默Cat S基因对骨肉瘤SAOS2细胞Wnt/β-catenin通路相关蛋白表达的影响

3 讨论

Cat S作为一种溶酶体酶有前体和成熟型两种形式，其被激活后首先会被分泌到细胞表面，然后再进入到细胞外环境中发挥作用[5]。有报道[6]称Cat S已被证实在包括肝细胞癌、脑癌和结肠癌等在内的一系列人类肿瘤类型中表达失控，同时Cat S表达的上调能诱导肿瘤的生长、侵袭、转移和血管生成。如，Cat S在肝癌细胞MHCC97-H中高表达，且抑制Cat S的表达可以有效抑制肝癌细胞增殖，迁移和血管生成[7]。在胃癌中，Cat S在16个胃癌细胞系和115个胃癌临床样本中高表达，且沉默Cat S可以有效抑制体外胃癌细胞的迁移和侵袭[8]。此外，Cat S还可以通过水解血脑屏障中的JAM-B蛋白促进肿瘤细胞渗入大脑，而抑制Cat S的表达可明显减少脑转移[9]。因此，Cat S被普遍认为是肿瘤治疗的新的潜在靶点。本研究发现Cat S在人骨肉瘤细胞SAOS2和MG63中高表达，敲低Cat S基因可以有效抑制人骨肉瘤细胞SAOS2和MG63的增殖、迁移和侵袭，并促进凋亡，提示了Cat S与骨肉瘤的发生发展密切相关并发挥着促癌作用。

Wnt/β-catenin信号通路已被诸多研究表明在癌症及骨质疏松等疾病过程中发挥了重要作用[10]。作为Wnt/β-catenin信号通路的关键调控因子，β-catenin的异常表达通常会导致细胞不能通过磷酸化和泛素化将其降解而致使β-catenin积累。随后，过量的β-catenin会进入细胞核内并激活对细胞分裂和生长至关重要的c-Myc和Cyclin D1并最终诱导细胞增殖生长。因此，β-catenin、c-Myc和Cyclin D1的异常表达通常与Wnt/β-catenin信号通路的激活有关，而这些关键蛋白也常被用作药物靶点来筛选可用于癌症治疗的小分子。在骨肉瘤中，FOXO1转录因子可以通过降低β-catenin的表达抑制人骨肉瘤细胞的活性进而阻止肿瘤的生长[11]。c-Myc作为一种多效性转录因子也已被证明在人骨肉瘤细胞中可以通过激活MEK-ERK通路促进癌细胞的迁移侵袭[12]。Cyclin D1是细胞周期进程的中心调节器，相比较正常细胞，Cyclin D1在人骨肉瘤细胞中的表达水平升高，并且过表达Cyclin D1可以有效促进人骨肉瘤细胞的生长[13]。除上述3种Wnt/β-catenin通路相关蛋白外，本研究还检测了LRP5的表达情况。LRP5是一种具有单次跨膜蛋白结构的低密度脂蛋白受体相关蛋白，同时也是Wnt/β-catenin通路介导的信号传导的共受体。临床研究已证实LRP5在骨肉瘤临床样本中表达升高，且LRP5的表达与骨肉瘤患者的不良预后呈正相关，提示了LRP5可作为诊断骨肉瘤进展的潜在生物标志物[14]。同时组织蛋白酶家族与Wnt/β-catenin通路的调控密切相关。例如，Basu et al[15]已报道了Cat D过表达通过增强Wnt/β-catenin通路促进了直肠癌细胞的过度增殖和转移。在本研究中，敲低Cat S基因可以下调LRP5、β-catenin、C-myc和Cyclin D1的表达，提示了Cat S低表达可能通过抑制Wnt/β-catenin通路参与了人骨肉瘤细胞的生长的过程。

综上所述，本研究表明Cat S在人骨肉瘤细胞SAOS2和MG63中呈高表达。敲低Cat S基因可以通过下调Wnt/β-catenin通路来抑制人骨肉瘤细胞SAOS2和MG63的增殖、迁移和侵袭并诱导凋亡。这些结果已经初步表明了Cat S可能是骨肉瘤分子靶向治疗的潜在靶点。后续研究将会通过加入Wnt/β-catenin通路激活剂来进一步验证Cat S对人骨肉瘤细胞增殖生长的调控作用，同时有关Cat S在骨肉瘤中的体内和临床研究也将一并展开。