SETDB1通过p53/p21通路调控结肠癌细胞衰老

吴 倩，侯吉学，贺 强，崔晓宾，黄桂林，孙旭凌

结肠癌在我国的发病率与死亡率分别居于第3位和第5位[1]。目前，针对结肠癌的靶向治疗研究在临床上受到越来越多的重视[2-3]，关于结肠癌发病机制的研究得到广泛关注。研究[4]显示，在部分相关肿瘤的发生及发展中，细胞衰老扮演着重要角色。结肠癌细胞中存在一种属于组蛋白赖氨酸N端甲基转移酶的组蛋白甲基化酶 SET结构域分支型1(SET domain bifurcated histone lysine methyltransferase 1，SETDB1)，其编码基因的位置在人类染色体 1q21 上，其过度表达和下调广泛存在于多种恶性肿瘤中[5-7]，但具体机制仍有待进一步的研究。鉴于课题组前期研究发现SETDB1可以影响细胞衰老[8]，遂以结肠癌细胞为研究对象，拟进一步探讨SETDB1在结肠癌发生发展中的作用，为进一步阐明结肠癌发病机制和开发新的靶向治疗策略提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料结肠癌细胞HT29、SW480由石河子大学医学院第一附属医院病理科提供；多柔比星(doxorubicin,DOX)购于德国Sigma公司；衰老β-半乳糖苷酶染色(SA-β-Gal)试剂盒、CCK8 试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司；转染试剂购于赛默飞世尔科技(中国)有限公司；p53和p21抗体、SETDB1和GAPDH购于美国圣克鲁斯生物技术(上海)有限公司；针对 SETDB1的 shRNA、过表达质粒与p53质粒购于上海吉凯基因化学技术有限公司；高糖培养基及嘌呤霉素等购于武汉启动子生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1稳转细胞系的建立 shRNA慢病毒用于感染预铺在6孔板中的SW480细胞(每孔约5×104个细胞)，首先5 μg/ml慢病毒感染细胞12 h，其次将培养基更换成高糖培养基。感染 72 h后，再将培养基更换为含2 μg/ml 嘌呤霉素的培养基。之后每2 d更换含嘌呤霉素的培养基，直到对照细胞完全死亡。使用MD2-G、PAX、pLKO-SETDB1三包系统进行高表达病毒包装，包装好的慢病毒立即感染HT29细胞系。

1.2.2细胞衰老β-半乳糖苷酶染色 将高表达SETDB1的HT29细胞及对照组细胞、低表达SETDB1的SW480细胞及对照组细胞预铺在6孔板中(每孔约5×104个细胞)，用DOX 0.25 μmol/L诱导不同组别的HT29细胞或SW480细胞，加β-半乳糖苷酶染色固定液1 ml，25 ℃静置30 min，PBS冲洗3次。每孔均加1 ml染色工作液，封口胶封闭6孔板保存在无CO2的37 ℃温箱中15 min，于显微镜下观察拍照。

1.2.3CCK8检测 将DOX预处理的HT29细胞及DMSO处理的对照组细胞、高表达SETDB1的HT29细胞及对照组细胞、低表达SETDB1的SW480细胞及对照组细胞铺在96孔板中(每孔3 000个细胞)，设复孔3个。待细胞贴壁，分别于0、24、48、72 h后，将混有10 μl CCK8的培养基100 μl加入每孔当中，孵育2 h后，酶标仪检测后绘制各时间点细胞生长曲线，比较细胞生长情况。

1.2.4Western blot检测 用蛋白裂解液提取不同处理组的细胞蛋白，计算好蛋白样品浓度及上样量。加样以SDS-PAGE胶电泳分离蛋白，湿转至PVDF膜，封闭孵育一抗1 h，4 ℃ 7 h，第2天孵育对应的二抗2 h，TBST洗30 min，利用ECL发光剂在曝光机下拍照。

1.2.5细胞周期检测 将DOX预处理的HT29细胞及DMSO处理的对照组细胞分别用胰酶消化后，低速离心弃上清液，在4 ℃环境下每管加入预冷的80%乙醇固定细胞7 h，低速离心洗涤弃上清液，分别将200 μl binding buffer、5 μl PI和5 μl RNase加入，吹打均匀后常温避光静置30 min后上流式细胞仪进行分析。

2 结果

2.1 SETDB1在DOX诱导的结肠癌细胞衰老模型中表达于HT29细胞中加入DOX 0.25 μmol/L诱导2 d，细胞衰老现象明显增加，以此确认SETDB1是否参与了结肠癌细胞衰老(图1A)。诱导组细胞增殖活性呈显著降低趋势(t=10.242,P<0.001，图1B)。同时诱导组细胞发生了G2/M期阻滞，证明DOX诱导结肠癌细胞的衰老模型构建成功(图1C、D)。另收集细胞行Western blot检测SETDB1的蛋白表达量，结果诱导组中SETDB1蛋白表达量较对照组明显下降，提示结肠癌细胞衰老过程中或许有SETDB1蛋白参与(图1E)。

图1 SETDB1在DOX诱导的结肠癌衰老模型中的表达

2.2 SETDB1对结肠癌细胞增殖的影响SETDB1在SW480细胞系和HT29细胞系均有表达，但表达差异有统计学意义(图2A)。利用慢病毒转染技术分别建立稳定低表达SETDB1的SW480细胞系和高表达HT29细胞系，并经Western blot检测证实(图2B、C)。在96 孔板中接种不同组细胞，CCK8 法检测不同组细胞在0、24、48和72 h时的增殖情况，结果发现低表达SETDB1抑制结肠癌细胞增殖(F=25.527,P<0.001，图2D)，而高表达SETDB1可促进结肠癌细胞的增殖(t=-6.328,P<0.01，图2E)。

图2 SETDB1对结肠癌细胞增殖情况的影响

2.3 SETDB1对结肠癌细胞衰老的影响利用β-半乳糖苷酶染色法对用DOX诱导后的稳定低表达SETDB1的SW480细胞和稳定高表达SETDB1的HT29细胞进行染色，观察不同组细胞中染色情况。结肠癌细胞的增殖能力在STEDB1低表达后下降，衰老细胞占比从(22.00±4.35)%增加至(54.00±5.56)%和(53.33±4.93)%(F=40.484,P<0.001，图3A、B)；结肠癌细胞的增殖能力在过表达STEDB1后上升，衰老细胞比例从(43.33±6.11)%降低至(21.33±3.51)%(t=5.407,P<0.01，图3C、D)。

图3 SETDB1对结肠癌细胞衰老的影响

2.4 SETDB1可对p53/p21通路进行调控GEO数据库分析发现SETDB1的表达与P53信号通路相关(图4A)，由Western blot证实p53及p21的蛋白水平在低表达SETDB1组细胞明显增高(图4B)，反之，过表达SETDB1可抑制p53及p21的蛋白表达(图4C)，提示改变SETDB1的表达可调节p53/p21 信号通路。进一步检测Vector、SETDB1及SETDB1+p53组细胞衰老水平，过表达SETDB1后结肠癌细胞衰老比例从(52.33±5.51)%降至(21.67±5.03)%(t=7.119,P<0.01，图4D)，经过p53 质粒转染，衰老细胞的占比则再次升至(40.67±4.04)%(t=-5.098,P<0.01，图4E)，由此证明过表达p53可以逆转高表达SETDB1引起的细胞衰老减少,说明结肠癌的细胞衰老可能是由SETDB1影响p53/p21信号通路调控来影响肿瘤的增殖。

图4 SETDB1通过p53/p21通路调控结肠癌细胞衰老

3 讨论

近年来，组蛋白相关功能的研究逐渐被医学界所重视。组蛋白甲基化由27种不同的甲基转移酶共同完成，这些甲基转移酶在特定的点起作用，发挥不同的生物学功能。当甲基转移酶SETDB1进入细胞质发挥非组蛋白的功能，可修饰p53细胞衰老[9-11]。目前参与细胞衰老调控的信号通路主要有p53/p21通路、Wnt/β-catenin通路，其中 p53/p21通路最为重要[12-13]。研究[14]表明，SETDB1是参与p53稳定性调节的重要调节器之一。为确定SETDB1是否会直接影响p53，利用GEO数据测序分析富集后呈现结果为低表达SETDB1时p53表达上调。

结肠癌是致人死亡的主要疾病之一。如何抑制结肠癌生长和转移的方式既是临床工作重点，也是基础科研的主攻方向。SETDB1或许在结肠癌中起了癌基因的作用，但其作用机制未完全阐明，需要进一步的研究来探索其分子机制。课题组在前期研究[8]中所建立的细胞衰老模型中发现，升高或降低SETDB1的表达量可以影响细胞衰老。近来临床研究[15]证实，细胞衰老在抗肿瘤和促进肿瘤发生特性的调节中SETDB1起到核心作用。有研究发现[12]，SETDB1在非小细胞肺癌患者中反复扩增和高表达。靶向SETDB1的抑制剂可能使过表达SETDB1的非小细胞肺癌患者受益。本研究发现，在肿瘤细胞衰老的过程中，SETDB1蛋白表达水平明显下降，提示肿瘤衰老的过程有SETDB1参与。并且进一步通过慢病毒转染稳定低表达RNA构建了低表达SETDB1的结肠癌细胞模型以此来阐明SETDB1可否调节结肠肿瘤的衰老。通过β-半乳糖苷酶染色提示SETDB1低表达确实可促进结肠癌细胞的衰老，其低表达可抑制结肠癌细胞增殖由CCK8实验来进一步揭示。以上证据证明，SETDB1通过p53/p21通路影响结肠癌细胞衰老进而影响肿瘤细胞的生长方式，对肿瘤起到调控作用。综上所述，本研究为SETDB1通过激活 p53/p21通路参与结肠癌细胞衰老过程提供了依据。