玉竹醇提取物B调控免疫代谢抗结直肠癌的药理机制研究

赵守彰 马强 权冬梅

1辽宁医药职业学院（沈阳 110101）；2沈阳市第六人民医院中西医结合肝病科（沈阳 110006）

有研究提示，结直肠癌（colorectal cancer，CRC）与各种原因引起的长期炎症以及自身免疫异常之间关系密切［1-2］。手术以及化疗依旧是CRC 治疗的主流，但传统西医治疗存在手术切除不完全以及骨髓抑制等问题［3］。寻求更为安全有效的治疗手段，是CRC 研究的新重点。玉竹是我国中医常用中药，其根茎内含有黄酮、生物碱、强心苷等多类物质，具有生津止渴、润燥除烦等功效。现代药理学研究发现，玉竹醇提取物B 具有抑癌功效，但其中的具体作用机制尚未明确［4-5］。为研究玉竹醇提取物B 是否能够通过调控免疫代谢抑制CRC，发挥抗癌功效，我院开展如下研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物实验动物为雄性BALB/CA⁃nu 裸小鼠，共25 只，SPF 级，5 周周龄，体质量（20±2）g，购自四川汇宇海玥医药。许可证号：SYXK（川）2021⁃234。小鼠所处环境符合相关标准的严格受控环境，温度（23 ± 1）℃，湿度（55 ± 5）%，光照时间为每日上午8：00～20：00，12 h 循环，小鼠标准饲料自由饮水，本研究经动物实验伦理批准（批准编号：2019JX0774）。

1.2 试验试剂及器材（1）试验试剂包括：小鼠IL⁃2 ELISA试剂盒、小鼠IL⁃12 ELISA试剂盒、TNF⁃α ELISA 试剂盒。红细胞裂解液购自Solarbio 公司。（2）试验仪器包括：全自动血细胞分析仪（型号HEMAVET950FS，美国）、组织匀浆器（S⁃18K，普莱特科技仪器）、高速离心机（型号：MiniSpin，德国Eppendorf）、流式细胞仪（型号：CytoFLEX，Beck⁃man Coulter）。（3）抗体：荧光抗体FITC⁃CD3e Mono⁃clonal Antibody（145⁃2C11）、APC⁃CD28 Monoclonal Antibody（37.51）。均购自Thermo Fisher Scientific。小鼠淋巴瘤细胞（YAC⁃1）购自美国模式培养物集存库（ATCC）。（4）玉竹醇提取物B 由沈阳药科大学免疫实验室提取，纯度≥95%，采用水醇法提取，取洗净切碎玉竹根茎，经30%乙醇浸提，取浸渍液，旋转蒸发仪蒸发回收乙醇，得黄棕色沉淀烤箱干燥后，定量，用双蒸水配成不同浓度，高压灭菌后备用。

1.3 动物模型建立及治疗方案（1）根据文献［6］中相关步骤建立CRC 小鼠模型：以脂质体2000 介导的chicken β⁃actin⁃GFP⁃neo 和chicken β⁃actinD⁃sRed⁃neo 转染人结肠癌细胞HCT⁃116，梯度浓度G418 筛选获得稳定表达红色和绿色荧光蛋白的细胞克隆并扩大培养，BALB/CA⁃nu 裸鼠皮下接种1 106 个发光细胞使其成瘤。（2）分组及给药方法：将25 只实验小鼠分为空白对照组、CRC 模型组及CRC+不同浓度玉竹醇提取物B 处理组（低剂量组、中剂量组、高剂量组），CRC+不同浓度玉竹醇提取物B 处理组小鼠分别给予1 g/kg、2 g/kg、3 g/kg玉竹醇提取物B 腹腔注射，空白对照组及CRC模型组给予等体积生理盐水腹腔注射，连续给药8 周。

1.4 血液及组织样本采集末次给药30 min后，抽取小鼠全血3 mL，使用1.5 mL EP 管采集全血，离心机4 000 rpm，离心10 min，微量移液器收集血清，置于-80 ℃冰箱内保存。血液采集完毕后，处死小鼠，取出其脾脏、心脏、肾脏及结直肠癌部位。计算脏器指数：脏器指数（mg/g）=脏器重量/小鼠总体质量。

1.5 外周血NK 细胞杀伤活性检测NK 细胞杀伤活性测定：末次给药30 min 后处死小鼠，取小鼠脾脏，配置LDH 基质液，复活YAC⁃1 靶细胞，制备脾细胞悬液，并将其浓度调整为1 × 107个/mL，台盼蓝细胞计数试验确保脾细胞悬液中细胞存活率＞95%，将100 μL 靶细胞与100 μL 效应细胞接种于U 型96 孔培养板，自然释放孔、最大释放孔及实验孔内分别加入：100 μL YAC⁃1+100 μL RPMI⁃1640，100 μL YAC⁃1+100 μL 1%NP⁃40，100 μL YAC⁃1+100 μL 脾细胞，孔板上每个孔都做3 个复孔，37℃、5%CO2环境下孵育2 h，将96 孔板离心（1 000 rpm，2 min）吸取96 孔板每孔100 μL 上清液平行放置于一个新的平底96 孔培养板，后置于饱和水汽培养箱中孵育10 min，向96 孔板中每孔加入100 μL LDH 基底液，将液体充分混匀静置于室温中避光15 min。使用多功能酶标仪读取570 nm处OD值，NK 细胞杀伤活性（%）=（实验孔OD值-自然释放孔OD值）/（最大释放孔OD值⁃自然释放孔OD值）×100%。

1.6 小鼠结直肠癌形成情况观察小鼠安乐死后，使用解剖剪剪开小鼠腹腔，找到整段肠道，生理盐水冲洗结直肠，每组小鼠选择三条完整的结直肠，延盲肠末端对其平行，放置在纸板上，拍照，对结直肠癌形成个数进行计数。

1.7 检测血清免疫相关指标水平采用ELISA 法检测血清白细胞介素⁃2（interleukin⁃2，IL⁃2）、白细胞介素⁃12（interleukin⁃12，IL⁃12）、肿瘤坏死因子⁃α（tumor necrosis factor⁃α，TNF⁃α）水平。严格按照试剂盒相关步骤进行操作。

1.8 统计学方法采用SPSS 19.0 统计软件处理数据。计量资料以（）表示，多组间比较行单方差分析，两两比较行LSD⁃t检验；计数资料用例（%）表示，组间比较行χ2检验，以P< 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠外周血NK细胞杀伤活性比较CRC模型组小鼠血液中NK 细胞对靶细胞的杀伤活性明显低于空白对照组，而不同浓度玉竹醇提取物组小鼠NK 细胞对靶细胞的杀伤活性较模型组升高，其中中剂量组NK 细胞杀伤活性高于低剂量组，高剂量组NK 细胞杀伤活性高于中剂量组。见表1、图1。

表1 各组小鼠外周血NK 细胞杀伤活性比较Tab.1 Comparison of peripheral blood NK cell killing activity among groups±s

表1 各组小鼠外周血NK 细胞杀伤活性比较Tab.1 Comparison of peripheral blood NK cell killing activity among groups±s

注：与空白对照组比较，*P<0.05，与模型组比较，#P<0.05，与玉竹醇低剂量组比较，aP<0.05，与玉竹醇中剂量组比较，bP<0.05

组别空白对照组模型组玉竹醇提取物低剂量组玉竹醇提取物中剂量组玉竹醇提取物高剂量组F 值P 值NK 细胞杀伤活性（%）50.16±13.25 32.17±6.52*35.96±5.41#37.51±7.03#a 42.25±6.65#ab 3.507 0.025

图1 各组小鼠外周血NK 细胞杀伤活性比较Fig.1 Comparison of peripheral blood NK cell killing activity among groups

2.2 各组小鼠外周血炎症因子水平比较与空白对照组相比，模型组小鼠外周血IL⁃2、IL⁃12 及TNF⁃α水平均下降，差异具有统计学意义（P< 0.05），而与模型组小鼠相比，不同浓度玉竹醇提取物组小鼠血清IL⁃2、IL⁃12 以及TNF⁃α 水平均上升，其中中剂量组血清IL⁃2、IL⁃12以及TNF⁃α水平水平高于低剂量组，高剂量组血清IL⁃2、IL⁃12 以及TNF⁃α 水平高于中剂量组，差异均具有统计学意义（P< 0.05）。见表2。

表2 各组小鼠外周血炎症因子水平比较Tab.2 Comparison of peripheral blood inflammation factors among groups±s

表2 各组小鼠外周血炎症因子水平比较Tab.2 Comparison of peripheral blood inflammation factors among groups±s

注：与空白对照组比较，*P<0.05，与模型组比较，#P<0.05，与玉竹醇低剂量组比较，aP<0.05，与玉竹醇中剂量组比较，bP<0.05

组别空白对照组模型组玉竹醇提取物低剂量组玉竹醇提取物中剂量组玉竹醇提取物高剂量组F值P值IL⁃2（pg/mL）623.15±61.46 317.59±60.36*413.15±53.69#469.99±67.15#a 546.58±66.87#ab 18.051<0.001 IL⁃12（pg/mL）1.91±0.21 1.26±0.24*1.45±0.25#1.59±0.34#a 1.85±0.29#ab 5.085<0.001 TNF⁃α（pg/mL）634.15±73.15 326.46±66.84*376.48±70.55#426.58±63.87#a 541.67±75.74#ab 15.978<0.001

2.3 各组小鼠脏器指数比较模型组与玉竹醇提取物组心脏及肝脏等指数比较，差异均无统计学意义（P> 0.05），但不同浓度玉竹醇提取物组脾脏指数及胸腺指数均较模型组高，其中中剂量组脾脏及胸腺指数高于低剂量组，高剂量组脾脏及胸腺指数高于中剂量组，差异均具有统计学意义（P<0.05）。

2.4 各组小鼠结直肠肿瘤形成情况比较解剖发现，模型组小鼠结直肠中可见肿瘤与其他异常增生，而经不同浓度玉竹醇提取物处理后的CRC模型小鼠结直肠中肿瘤与其他异常增生数目明显减少［（8.83±0.71）vs.（4.68±0.46）vs.（3.41±0.78）vs.（2.13±0.53），F=65.642，P<0.001］。见图2。

表3 各组小鼠脏器指数比较Tab.3 Comparison of organ index among groups±s

表3 各组小鼠脏器指数比较Tab.3 Comparison of organ index among groups±s

注：与空白对照组比较，*P<0.05，与模型组比较，#P<0.05，与玉竹醇低剂量组比较，aP<0.05，与玉竹醇中剂量组比较，bP<0.05

组别空白对照组模型组玉竹醇提取物低剂量组玉竹醇提取物中剂量组玉竹醇提取物高剂量组F 值P 值心脏指数9.39±1.13 9.41±1.02 9.36±1.23 9.37±1.21 9.43±1.18 0.003 1.000肝脏指数50.13±2.34 48.79±3.33 49.59±2.79 50.02±3.51 48.66±2.83 0.261 0.899脾脏指数13.69±1.69 5.14±1.33*7.43±1.52 9.41±1.37 11.85±2.03 22.414<0.001肺脏指数6.76±1.47 6.69±1.53 6.94±1.61 6.84±1.45 6.91±1.55 0.021 0.999肾脏指数12.68±1.43 13.03±1.39 12.95±1.37 12.87±1.65 12.91±1.74 0.032 0.998胸腺指数1.65±0.24 0.76±0.21*1.33±0.27#1.47±0.19 1.62±0.17 13.682<0.001

图2 各组小鼠结直肠肿瘤形成情况比较Tab.2 Comparison of colorectal tumor formation in mice of each group

3 讨论

CRC 是临床常见的消化系统恶性肿瘤，具有发病率高的特点。手术治疗是CRC 的首选，但对于部分晚期CRC 患者，术后依旧存在肿瘤转移及复发风险，而联合化疗可能导致骨髓抑制问题。中药治疗安全性高，在辅助多种恶性肿瘤的治疗中均具有良好的疗效［7-9］。

玉竹醇提取物B 提取自传统中草药玉竹，有研究表示［10-11］，玉竹醇提取物B 能抑制肿瘤形成，延长荷瘤小鼠生存时间。本研究发现，经与玉竹醇提取物B 干预后，CRC 小鼠结直肠处肿瘤数目及异常增生均较未经治疗的模型组明显减少，说明玉竹醇提取物B 在CRC 中也具有抗癌功效，与上述研究结果一致。但关于玉竹醇提取物B 在抗癌中的具体作用机制尚不明确。

自身免疫异常是CRC 发病及发展的重要原因，同时，免疫功能调节也是机体抗癌的重要组成。免疫功能调节能激活机体免疫细胞活力，杀伤癌细胞，实现免疫介导的癌细胞清除［12-14］。为探讨玉竹醇提取物B 是否能够通过调控免疫功能，在CRC 中发挥作用，本研究检测CRC 玉竹醇提取物B 干预的CRC 小鼠免疫相关指标。NK 细胞是免疫系统的重要作用细胞，其能有效识别、杀死恶性细胞，并维持机体免疫稳态［15-17］。本研究结果提示，玉竹醇提取物组小鼠血液中NK 细胞对靶细胞的杀伤活性明显高于模型组，说明玉竹醇提取物B 能有效提高结直肠癌大鼠免疫功能。

ILs 及TNFs 都具有免疫调控和抗肿瘤活性，免疫相关细胞因子具备抗肿瘤活性作用［18-20］。其中IL⁃2 不仅能促进NK、T 细胞以及B 细胞增殖，还能增强T 细胞及NK 细胞对肿瘤的杀伤作用，进而增强机体对肿瘤的特异性免疫作用。IL⁃12 可提高NK 细胞活性，促进TNF⁃α 分泌，进而强化肿瘤细胞杀伤能力［21-22］。我院研究发现，与CRC 模型小鼠相比，经玉竹醇提取物B 干预的CRC 小鼠血清IL⁃2、IL⁃12以及TNF⁃α水平均明显上升，脾脏及胸腺是机体免疫调节的重要器官，本研究发现，与空白健康小鼠相比，CRC 模型小鼠脾脏及胸腺指数均下降，说明CRC 存在明显的免疫紊乱状况［23-25］。而经玉竹醇提取物B 干预后，CRC 小鼠以上两脾脏指数均较模型组上升。解剖发现，模型组小鼠结直肠中可见肿瘤与其他异常增生，而经不同浓度玉竹醇提取物处理后的CRC 模型小鼠结直肠中肿瘤与其他异常增生数目明显减少提示玉竹醇提取物B 可通过调节免疫系统功达到抑制结直肠癌效果。

综上所述，玉竹醇提取物B 可能通过调节免疫代谢减少CRC 结直肠肿瘤数目及异常增生，发挥抗癌作用。