贮藏温度对纳米晶纤维素/壳聚糖涂膜保鲜效果的影响

曹思源，李保祥，何悦，刘敏，吴习宇,2，任丹,2，徐丹,2*

1(西南大学 食品科学学院，重庆，400700)2(西南大学 食品贮藏与物流研究中心，重庆，400700)

柑橘是世界上产量最大也是最受消费者欢迎的水果之一，味道甜美且营养价值高[1]。但柑橘果实的成熟期较为集中，在采后贮藏和运输过程中失水率高且容易腐烂，造成了较大的经济损失和资源浪费[2-3]。据国家统计局调查数据显示，2019年我国的柑橘产量为4 584.54万t。但我国的柑橘果实采后贮藏与保鲜技术与发达国家相比还较为落后，果实的采后损失率高达20%～30%[4]。控制采后果实的贮藏温度，以降低果实的采后呼吸和蒸腾速率，可显著延缓果实的衰老，是目前果实采后保鲜最常用的技术手段。但柑橘果实在低温下贮藏容易遭受冷害，且运输和销售过程中的环境温度波动较大，仅依靠环境温度的调节难以达到最佳的保鲜效果。

近年来，可食性涂膜技术作为一种易于操作、效果显著且安全无毒的保鲜方式受到了广泛关注。涂覆在果实表面的半透性可食性薄膜，作为果实与环境之间的屏障，具有调控果实的呼吸作用、降低水分散失和抵御病菌侵染等作用，进而延长果实的货架期[5]。研究表明，涂膜还可维持柑橘果实细胞膜氧化酶活性以及细胞膜结构的稳定性，从而有效提高果实对低温的耐受性，减少冷害的发生[6-8]。因此，将涂膜保鲜技术与温控技术联用，有望进一步减少柑橘果实在贮运过程中的损失。但果实的呼吸强度随贮藏温度的降低而下降，因此涂膜对果实呼吸的调节作用也受温度的影响。同时，本项目组在前期研究中发现，在果实的呼吸和蒸腾作用下，亲水性的壳聚糖(chitosan，CS)涂膜在贮藏期间会出现微孔，导致涂膜的致密结构被破坏而削弱其对果实的屏障作用，降低涂膜保鲜效果。在涂膜中添加纳米晶纤维素(nanocrystal cellulose，NCC)可提高涂膜结构的稳定性，延缓微孔的出现，进而提高其保鲜效果[9]。同时，果实的呼吸速率越快，涂膜中的微孔出现得越早。由此可见，贮藏温度不仅会影响涂膜对果实的呼吸调控作用，也会影响涂膜结构的变化，进而影响其保鲜效果。但目前鲜有文献对不同贮藏温度下的涂膜保鲜效果进行研究。因此，本文在前期的研究基础上，采用NCC质量分数为6%的壳聚糖复合涂膜液对红桔果实进行涂膜处理后，将其与未处理的对照组在不同温度(4、8、12 ℃)下贮藏，对果实的营养物质含量、抗氧化酶活性等进行监测，并定期观察涂膜的表面微观形貌，以探究温度对涂膜保鲜效果的影响及机理。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

红桔(CitrustangerineHort.ex Tanaka)，采于重庆市北碚区果园。壳聚糖，脱乙酰度为90%，分子质量为180 kDa，潍坊海之源生物制品有限公司；NCC 分散液，质量分数为1.15%，天津市木精灵生物科技有限公司，采用2，2，6，6-四甲基哌啶氧化物(2,2,6,6-tetramethylpiperidine oxide，TEMPO)氧化法制备；其余试剂均为分析纯。

1.1.2 仪器与设备

L530R型台式低速冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；Epoch2型酶标仪光度计，BioTek Instruments, Inc；ProX型台式扫描电镜能谱一体机，PhenomWorld, Inc。

1.2 试验方法

1.2.1 实验样品处理

将一定量的NCC悬浮液(NCC干重为壳聚糖干重的6%)添加至1%(体积分数)的乙酸水溶液中，磁力搅拌30 min。在均匀混合的NCC溶液中加入一定量壳聚糖，使壳聚糖质量浓度达到15 g/L，并持续搅拌24 h得到均匀NCC/CS复合膜液备用。

在当天采摘的红桔中选取成熟度、质量和大小一致的果实。清水洗净后，在质量分数为2%的NaClO溶液中浸泡2 min消毒。常温晾干水分后将其随机分为6组，每组约80个果实。对照组不再进行任何处理，共3组，分别置于温度为(4±1)、(8±1)和(12±1)℃，湿度为(60±10)%的环境中贮藏，分别记为4 ℃对照、8 ℃对照和12 ℃对照。涂膜组用NCC质量分数为6%的NCC/CS 复合膜液通过刷子均匀涂覆桔皮，自然风干，分别置于温度为(4±1)、(8±1)、(12±1)℃，湿度为(60±10)%的环境中贮藏，分别记为4 ℃涂膜、8 ℃涂膜和12 ℃涂膜。每组中随机选取30个果实用于失重率和腐烂率的检测，从1～30进行标号并记录其初始质量m0。每2 d从各组其余果实中随机取出5个无损鲜果，将鲜果果肉榨汁，并用4层纱布过滤，采用过滤后的果汁测定其品质指标。

1.2.2 检测指标与方法

1.2.2.1 腐烂率

每2 d观察果实表面是否有病斑、腐烂、软化等现象，如有则记为烂果，记录从第0天至测量当天每组的累计烂果数，腐烂率计算如公式(1)所示：

(1)

1.2.2.2 失重率

初始果实质量为m0,每2 d对1～30号果实进行单果称重，记当天质量为mt，失重率按公式(2)计算：

(2)

1.2.2.3 可滴定酸含量

参考文献[10]的方法测定，结果用%表示。

1.2.2.4 可溶性固形物含量

采用阿贝折射仪测定，用%表示。

1.2.2.5 可溶性蛋白质含量

参考文献[10]的方法测定，结果用μg/g表示。

1.2.2.6 丙二醛含量

参考文献[10]的方法测定，结果用μmol/kg表示。

1.2.2.7 抗坏血酸含量

参考GB 5009.86—2016《食品安全国家标准 食品中抗坏血酸的测定》，采用2，6—二氯丁酚滴定法进行测定，结果用mg/100 g表示。

1.2.2.8 总酚含量

参考文献[10]的方法测定，结果以每克样品含有微克没食子酸表示，μg/g。

1.2.2.9 过氧化物酶(peroxidase, POD)活性

用愈创木酚法测定，具体步骤参考文献[10]的方法进行，以每克红桔汁样品每分钟吸光度变化值增加1作为1个POD活性单位，用U/g表示。

1.2.2.10 过氧化氢酶(catalase, CAT)活性

采用Solarbio过氧化氢酶活性检测试剂盒测定，测试过程参照试剂盒说明书，结果用U/g表示。

1.2.2.11 DPPH自由基清除率

用无水乙醇配制1 mmoL/L DPPH溶液。用5 mL无水乙醇提取0.5 g红桔样品，在4 ℃下以4 500 r/min离心30 min，吸取2 mL上清液加入2 mL 1 mmol/L的DPPH溶液在室温下反应1 h，以无水乙醇做参比液在518 nm处测量样品液吸光度值，DPPH自由基清除率计算如公式(3)所示：

(3)

式中：A0，无水乙醇在518 nm处的吸光度值；A1，样品液在518 nm处的吸光度值。

1.2.2.12 扫描电子显微镜分析

首先将桔皮样品在液氮中脆断，然后将干燥的膜样品切成方形小块(10 mm×10 mm)，用导电胶将其固定在样品台上进行喷金处理，最后用扫描电镜观察桔皮表面结构与形貌，加速电压设置为10 kV。

1.3 数据处理

每个样品进行3次重复，结果以“均值±标准偏差”表示，进行单因素方差分析，若数据有显著性差异，再进行Duncan法多重比较，显著性水平为0.05。

2 结果与分析

2.1 腐烂率

各组红桔果实在贮藏期间的腐烂情况如图1所示。对照组中，贮藏于4、12 ℃果实的腐烂率上升较快，尤其是12 ℃对照组，至第12天时其腐烂率高达53.3%；而8 ℃对照组的腐烂率则显著低于以上2组。涂膜组中，12 ℃贮藏的果实同样具有较高的腐烂率，而4、8 ℃贮藏的涂膜组则在贮藏第6天才出现腐烂，并在整个贮藏期间均维持了较低的腐烂率，尤其是8 ℃涂膜组，至第12天时其腐烂率仅为12 ℃对照组的50%。红桔的最适贮藏温度一般为8～10 ℃，实验结果也表明8 ℃贮藏的对照组和涂膜组均具有较低的腐烂率。贮藏温度过低(4 ℃)，果实容易发生冷害，腐烂程度加重[11]；贮藏温度过高(12 ℃)，则果实的呼吸速率高，且病原菌繁殖速度快，其衰老和腐烂速率加快。同时，与相同贮藏温度的对照组相比，涂膜组的腐烂速率均明显降低。贮藏12 d时，12、8和4 ℃涂膜组的腐烂率相较于相同温度下的对照组分别降低了37.5%、12.5%和27.3%。由此可看出，12 ℃时，涂膜处理对红桔腐烂的抑制效果最好，其次为4 ℃，而8 ℃时，涂膜抑制果实腐烂的效果不显著。

涂膜主要通过其半透性来减少果实内部与外界的气体交换，降低果实的呼吸强度。因此，在较高温度下(12 ℃)，果实具有较高呼吸强度时，涂膜可更好地发挥其抑制果实呼吸的作用，延缓其衰老；在较低温度下(4 ℃)，涂膜可提高果实的低温耐受能力，降低其腐烂率。而8 ℃时，果实的呼吸作用已减缓，各项生理活动也随之减弱，因此涂膜对果实呼吸的调控作用较为有限。

2.2 失重率

红桔果实在贮藏期间的失重情况如图2所示，可以看出贮藏温度对果实的失重率具有显著影响(P<0.05)。各组果实在4 ℃下的失重率最低，并随贮藏温度的升高而逐渐增加。同时，相同温度下对照组和涂膜组果实失重率之间的差异也随温度上升而增加。贮藏在4、8 ℃下的对照组和涂膜组果实的失重率在贮藏期间均无显著差异(P>0.05)，而12 ℃涂膜组的失重率在贮藏第8天后显著低于对照组(P<0.05)。果实在贮藏期间的质量下降主要源于蒸腾作用导致果实内部水分散失[12]，而失水不仅影响果实的口感，且可造成细胞膨压降低，引起组织萎蔫，果品光泽消失。低温下，果实的蒸腾速率降低，且果皮蜡质层较为稳定[13]，可较好地保持其结构稳定，防止果实失水[14]。因此，果实的失重率随温度降低明显下降。但涂膜仅在果实失重率较高时起到抑制果实失重的作用，这可能是由于壳聚糖/纳米纤维素复合涂膜的阻湿性较差，主要通过其对果实呼吸作用和生理活动的抑制来起到降低果实失重的作用。

2.3 果肉中营养物质的含量变化

由图3-a可知，各组果实中抗坏血酸含量在贮藏期间均呈波动变化状态。抗坏血酸是果蔬中非酶类抗氧化剂，贮藏过程中在抗坏血酸氧化酶的作用下被氧化，其脱下的氢离子与活性氧结合，减少自由基的累积。抗坏血酸在抗氧化过程中被消耗造成含量降低[15]；而果实在贮藏过程中发生的采后成熟、生物合成、氧化和再循环等过程则会造成抗坏血酸含量的上升[16]。以上2种作用造成了果实中抗坏血酸含量的波动。12 ℃对照组果实中的抗坏血酸含量在贮藏前6 d波动幅度较大，可能是由于贮藏温度较高，果实的生理活动较强导致，但12 ℃涂膜组的抗坏血酸含量与4、8 ℃贮藏果实较为接近，说明涂膜抑制了果实的生理活动，有利于稳定果实中营养物质的含量。

由图3-b可知，各组果实的总酚含量随贮藏时间均呈先下降后上升的趋势，与冉皓杰等[17]研究结果一致。酚类化合物是果实的次生代谢产物，具有防御功能，其含量变化反应了果实成熟度及对环境胁迫产生的应激反应[18]。贮藏前期，果实生理活动剧烈，酚类物质被氧化、消耗，导致其含量降低。此时各温度下涂膜组果实总酚含量降低速率低于其相同温度下的对照组。贮藏后期，细胞氧化受损，果实合成总酚作为防御物质，因此总酚含量也反映了细胞的受损情况[19]。各组果实中，其中12 ℃对照组果实总酚含量上升最为明显，其余组的总酚含量较为接近，说明贮藏温度越高，果实细胞受损衰老越严重，但涂膜可缓解这一现象。

由图3-c可知，各组果实可溶性固形物含量总体先下降后上升。糖分是可溶性固形物的主要组成成分，在贮藏初期被消耗转化为CO2和O2，含量下降。而随着果实的失水和衰老，细胞壁水解产生的多糖和部分淀粉的相继水解又会造成可溶性固形物含量的逐渐上升至相对稳定[20]。相同温度下对照组与涂膜组变化趋势较为一致。贮藏中期(第6～8天)，贮藏于4、8 ℃下的对照组果实中的可溶性固形物含量高于相同温度下的涂膜组，但贮藏后期差异减小，说明在这2个温度下涂膜可减少果实中糖分的消耗。

可溶性蛋白是构成果蔬中酶的重要组成部分，参与了多种生理生化反应的调控，同时也是重要的营养物质和渗透调节物质[21]。由图3-d可知，在贮藏初期，呼吸作用较强，可溶性蛋白快速水解，导致各组果实内其含量锐减。但在贮藏2 d后，可溶性蛋白的含量较为稳定，且各组之间无显著差异(P>0.05)，说明涂膜和贮藏温度对贮藏后期果实的可溶性蛋白含量无显著影响。

a-抗坏血酸；b-总酚；c-可溶性固形物；d-可溶性蛋白质图3 红桔果实在不同贮藏温度下的营养物质含量变化Fig.3 Changes of nutrient contents of red tangerines fruits under different storage temperatures

2.4 丙二醛含量变化

如图4所示，贮藏期间所有实验组果实的丙二醛含量均随贮藏时间延长而上升。丙二醛作为脂质过氧化作用的次要终产物，常被用作膜完整性丧失的代谢指标[22]，反映膜受损的情况。从图4可看出，4、8 ℃贮藏的果实中丙二醛含量增速相对缓慢，且各组的含量在贮藏期间除第10天外均无显著性差异(P>0.05)。12 ℃贮藏果实的丙二醛含量则随贮藏期的延长而迅速增加，尤其是12 ℃对照组。由此进一步说明，贮藏在较高温度(12 ℃)下的果实细胞膜脂氧化较快，衰老加快，与陈小红[23]的研究结果一致。但NCC/CS涂膜可抑制果实呼吸，从而降低果实的过氧化程度，延缓果实衰老。

图4 红桔果实在不同贮藏温度下的丙二醛含量变化Fig.4 Changes of MDA content in red tangerines fruits under different storage temperatures

2.5 DPPH自由基清除率与抗氧化酶活性变化

由表1可知，随贮藏时间的延长，红桔果实的DPPH自由基清除率总体呈下降趋势，即其抗氧化能力下降。果实贮藏第12天时，各组果实中DPPH自由基清除率最低的为8 ℃对照组，最高的为12 ℃涂膜组。果实的DPPH自由基清除率取决于其抗氧化物质的含量，从2.3节可看出，果实中的抗坏血酸和总酚等营养物质含量均呈先下降后上升的趋势，与表中各组果实的DPPH自由基清除率变化趋势较为一致。同时，除4 ℃贮藏的果实外，其余贮藏温度下的涂膜组果实的DPPH自由基清除率在贮藏后期均显著高于对照组(P<0.05)，说明NCC/CS涂膜可有效延缓果实抗氧化能力的降低，有助于增强其防御能力。

表1 贮藏温度和NCC/CS涂膜对红桔贮藏期DPPH自由基清除率的影响Table 1 Effect of storage temperature and NCC/CS coating on DPPH free radical scavenging rate of tangerine during storage

POD作为果蔬内重要的氧化还原酶之一，在降低活性氧积累、延缓膜脂过氧化进程以及维持细胞膜完整性中都承担着重要作用。它能够清除植物组织中的活性氧自由基，保护细胞膜脂，但是它也可以产生酚自由基，促进果蔬采后衰老[24-25]。由图5-a可知，贮藏前2 d果实POD活性有所上升，可能是果实的环境应激反应。此后，12 ℃对照组果实的POD活性持续下降，说明果实的衰老较快，与陈超等[26]的研究结果一致，而4 ℃对照组则保持稳定的活性直至第12天时迅速下降，可能是由于果实遭受冷害导致细胞损伤。但12和4 ℃贮藏的涂膜组果实的POD活性变化趋势则与8 ℃贮藏的对照组和涂膜组一致，均在第8天达到峰值而后下降。由此说明，涂膜可在贮藏温度较高时维持抗氧化酶活性，延缓果实的衰老，且在温度较低时保护果实细胞免受损伤。

a-POD活性;b-CAT活性图5 红桔果实在不同贮藏温度下的抗氧化酶活性变化Fig.5 Changes of antioxidant enzyme activity in red tangerines fruits under different storage temperatures

CAT是植物生长系统防御的关键酶之一，它在氧化应激条件下对清除活性氧起着必不可少的作用[27]。图5-b所示，8和12 ℃贮藏的对照组果实的CAT活性在第4天达到峰值，而贮藏在相同温度下的涂膜组果实CAT活性则在贮藏第8天才开始显著上升(P<0.05)，说明涂膜减少了自由基的积累，推迟了CAT启动防御的时间。果实如出现冷害，会造成细胞超微结构变化，例如质体降解和过氧化物酶体的消失等[28-30]，使得抗氧化酶活力下降[27]。图5-b中可看出4 ℃对照组果实的CAT在整个贮藏期间均维持较低的活性，但涂膜组果实的CAT活性从第8天开始上升且在第10天达峰值，与POD活性变化较为一致。由此说明，4 ℃贮藏的对照组果实出现了冷害，而涂膜处理能有效提高CAT参与活性氧代谢程度，减轻冷害症状。

2.6 红桔果皮形貌变化

图6所示为各组红桔表皮的微观形貌随贮藏时间的变化。对照组果皮上的蜡质层结构随贮藏时间的延长而逐渐被破坏，尤其是贮藏于12 ℃的果实，在第12天时蜡质层出现了明显的破裂和剥离。经涂膜处理后，果实表面被致密的NCC/CS涂膜所覆盖，气孔消失。随着贮藏时间的延长，在果实气孔处的呼吸和蒸腾作用下，亲水性的NCC/CS涂膜的结构被破坏，果实气孔位置处出现微孔，与前期研究结果一致[9]。且该微孔的出现时间随着贮藏温度的升高而提早，贮藏第6天时，4 ℃贮藏果实表面的涂膜未观察到微孔，8 ℃贮藏果实的涂膜开始形成微孔；而12 ℃贮藏果实的涂膜则早在第2天便观察到了微孔，且在第6天时涂膜出现了局部脱落的现象。由此说明，NCC/CS涂膜的稳定性确实与贮藏温度有关，贮藏温度越低，果实的呼吸与蒸腾作用速率降低，涂膜出现微孔的时间也越晚。贮藏于12 ℃的果实虽然在后期涂膜结构被破坏，但由于涂膜前期的保护作用，例如显著降低果实的过氧化程度，因此涂膜组果实的腐烂率在贮藏后期仍然显著低于对照组。

图6 各组红桔果实在不同贮藏温度下的果皮形貌变化Fig.6 Changes of peel morphology of red tangerines fruits in each group under different temperatures

3 结论

本研究考察了NCC/CS涂膜组与对照组红桔果实在4、8、12 ℃下贮藏时的品质与酶活性变化。结果表明，在最佳贮藏温度8 ℃下，红桔果实能维持较低的呼吸强度且不会出现冷害，此时NCC/CS涂膜对果实的贮藏品质无显著提高。贮藏于12 ℃的红桔果实，呼吸作用较强，衰老加快导致其在贮藏后期迅速腐烂，但涂膜组果实具有显著降低的腐烂率、失重率和丙二醛含量，且保持了较为稳定的可溶性固形物、可溶性蛋白质含量以及POD和CAT的活性。同时，贮藏在4 ℃的红桔果实易发生冷害而腐烂，但涂膜处理可显著(P<0.05)降低其腐烂率和丙二醛含量，并推迟POD和CAT活性高峰，增强了果实的耐冷害能力。果实表面的涂膜随贮藏时间的延长而出现微孔，但其稳定性随贮藏温度降低而提高。因此，NCC/CS涂膜在贮藏温度较高时可适当抑制果实呼吸，在贮藏温度较低时可减少冷害的发生，有助于提高果实在贮运过程中对温度波动的耐受度，起到减损保鲜的效果。