浅层X射线照射的间隔时间对瘢痕疙瘩成纤维细胞胶原分泌的影响

郑文月, 马季, 臧海英, 冯清蓝, 王维佳, 米次仁, 邓成成,朱定衡

1.南方医科大学，广东 广州 510515；2.南方医科大学皮肤病医院，广东 广州 510091

瘢痕疙瘩是成纤维细胞异常增殖、胶原过度累积的病理性瘢痕组织，存在与肿瘤相似的表观遗传学改变[1-3]。单一治疗手段难以达到理想的控制效果，手术联合术后放疗被证实能有效预防瘢痕疙瘩复发[4]。目前临床报道手术联合早期浅层X射线放疗对控制瘢痕疙瘩的复发更为有效[5]。据报道，瘢痕疙瘩放疗在5 Gy剂量组疗效较对照组差异有统计学意义[6]，且复发率与总剂量相关[7]，而关于放疗的最适间隔周期尚无定论。本研究旨在探讨不同间隔周期浅层X射线照射人瘢痕疙瘩成纤维细胞(human keloid fibroblasts，HKF)后，HKF及细胞外基质胶原蛋白表达的改变。

1 材料与方法

1.1 实验材料

标本来源于2021年1月至2021年12月南方医科大学皮肤病医院行手术切除的瘢痕疙瘩标本6例，其中稳定期2例，进展期4例。所有瘢痕疙瘩患者均局部无感染溃疡，未接受过任何药物及放射治疗。经临床及病理确诊后，所有标本取材均已获得患者本人或监护人的知情同意。研究经医院伦理委员会审批通过。

1.2 试剂

DMEM培养基(美国Thermo Scientific)，胎牛血清(FBS，以色列Biological Industries)，Trizol和PrimeScriptTMRT reagent Kit反转录试剂盒(日本Takara)，上下游引物(上海生工生物工程有限公司)，SYBR Green Premix qPCR Kit(湖南艾科瑞生物工程有限公司)，兔抗人Collagen Ⅰ抗体(美国CST)，兔抗人Collagen Ⅲ抗体(美国Abcam)，Human Collagen Ⅰ ELISA Kit(南京建成生物工程研究所有限公司)，SRT-100 VisionTM浅层放射治疗系统(美国Sensus Health)。

1.3 方法

1.3.1 HKF的分离培养 于南方医科大学皮肤病医院手术室无菌条件下收集人瘢痕疙瘩组织用于提取和培养原代HKF。于超净细胞台用含双抗的RPMI-1640培养液多次冲洗瘢痕组织，用剪刀尽量剪去真皮下脂肪组织，将每块组织剪至约0.1 cm×0.1 cm大小的矩形，加入含血清的DMEM培养基，培养于37 ℃、5% CO2的细胞孵箱中，当细胞密度长至80%时，倒置显微镜观察细胞，并进行传代。本实验中使用传至第3代的成纤维细胞。

1.3.2 不同间隔周期浅层X射线照射HKF 取4×105/孔处于对数生长期的HKF接种于培养皿中培养24 h。根据照射间隔时间不同，分别设间隔1、2、3、4、5、6、7 d 7个组，设置无照射空白对照组(0 d)，共8组。实验中需照射细胞均采用S-100浅层X射线放射治疗系统，1～7组分别间隔1～7 d进行照射，所有组单次照射剂量均为5 Gy，2.6 min，共照射3次;空白对照组不照射。

1.3.3 Western blot检测各组HKF中Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白的表达 第22天(从实验组第1次照射起算)，收集8组HKF，裂解破碎细胞，收集细胞总蛋白，BCA法蛋白定量。制备好的蛋白样品经SDS-PAGE凝胶电泳后，转移至聚氟乙烯(PVDF)膜。5%脱脂奶粉室温封闭2 h后，分别加入稀释的一抗，Ⅰ 型胶原蛋白(1∶1 000)，Ⅲ型胶原蛋白(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，加入稀释的酶标二抗，室温孵育2 h。显影，拍照定影，以GAPDH作为内参，分析蛋白表达水平。

1.3.4 qRT-PCR检测各组HKF中Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白的mRNA表达水平 利用Trizol法提取细胞总RNA，采用反转录试剂盒进行反转录。PCR反应条件：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，90 ℃ 15 s。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCT法分析目的基因mRNA相对表达水平。引物由中国生工生物工程公司合成(表1)。

表1 引物序列

1.3.5 ELISA检测各组HKF培养上清液中Ⅰ型胶原蛋白的表达 收集HKF培养上清液，ELISA检测Ⅰ型胶原蛋白的分泌水平，实验步骤严格按照ELISA检测试剂盒说明书操作，最后在酶标仪中读取各孔450 nm波长处的OD值，根据标准曲线计算各组HKF培养上清液中Ⅰ型胶原蛋白的浓度。

1.4 统计学处理

采用 GraphPadPrism 9.0软件进行统计学分析，数据以均数±标准差表示，结果至少经3次独立重复试验计算得出，对照组与不同间隔周期浅层X射线照射组比较采用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同间隔周期浅层X射线照射对HKF中Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白mRNA表达水平的影响

不同间隔周期浅层 X射线照射处理后，与未处理组(0 d)相比，各实验组HKF细胞中 Ⅰ 型胶原蛋白mRNA表达水平均明显降低。其中，间隔3 d组(t=12.09，P<0.01)最低(图1)；各实验组HKF细胞中Ⅲ型胶原蛋白亦降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，其中，间隔3 d组Ⅲ型胶原蛋白表达出现升高值，与对照组有统计学差异(t=5.22，P<0.05，图1)。Ⅰ型胶原蛋白/Ⅲ型胶原蛋白mRNA比值与未处理组相比，间隔3 d组下降值最明显，差异有统计学意义(t=6.67，P<0.01)，而间隔7 d Ⅰ型胶原蛋白/Ⅲ型胶原蛋白mRNA比值与未处理组相比，差异无统计学意义。

图1 不同间隔周期浅层X射线照射后各组Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白mRNA表达水平

2.2 不同间隔周期浅层X射线照射对HKF中Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白表达水平的影响

不同间隔周期浅层 X射线照射处理后，各实验组HKF细胞中Ⅰ型胶原蛋白与未处理组比较差异均有统计学意义(均P<0.05)，间隔1 d组出现低峰值(t=9.97，P<0.01,图2);各实验组Ⅲ型胶原蛋白水平与未处理组比较，亦有统计学差异(P<0.01)。与未处理组相比Ⅰ型胶原蛋白/Ⅲ型胶原蛋白比值在间隔3 d下降值最明显(P<0.01)，而间隔5 d(t=0.21，P>0.05)和间隔7 d(t=0.66，P>0.05)Ⅰ型胶原蛋白/Ⅲ型胶原蛋白比值无明显变化，差异无统计学意义。

图2 不同间隔周期浅层X射线照射后各组Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白表达水平

2.3 不同间隔周期浅层X射线照射对HKF培养上清液中Ⅰ型胶原蛋白表达水平的影响

不同时间间隔浅层 X射线照射处理后，与未处理组相比，各实验组HKF培养上清中Ⅰ型胶原蛋白分泌水平明显降低，差异有统计学意义(均P<0.05)。间隔3 d(t=5.95，P<0.01)和6 d组(t=5.53，P<0.001)培养上清中Ⅰ型胶原蛋白表达出现两个低峰值，呈一定的时间依赖性(图3)。

图3 不同间隔周期浅层X射线照射后各组HKF分泌上清中Ⅰ型胶原蛋白水平

3 讨论

瘢痕疙瘩是临床常见的病理性瘢痕，主要组织学特征为局部成纤维细胞过度增殖和细胞外基质成分过度堆积[8]。瘢痕疙瘩具有侵袭性生长、增殖和分化异常等特点，最关键的特点是有类似肿瘤的缺氧微环境[9]，放射疗法通过直接或间接电离作用抑制细胞分裂和增殖，作为肿瘤的主要治疗手段之一，同样适用于瘢痕疙瘩[10]。目前研究表明，在不同剂量电离辐射作用下，放疗后不同阶段可通过激活整合素和生长因子受体增强辐射诱导的G2/M细胞周期停止、凋亡或其他生物学改变[11]。HKF经电离辐射后引起DNA损伤诱导衰老表型，参与成纤维细胞的染色质重塑[12]，且大量研究证据表明衰老与表观遗传密切相关[13]。然而，放射治疗通过改变细胞周期或微环境调控表观遗传网络治疗瘢痕疙瘩的具体机制还有待进一步研究。

浅层X射线联合术后放疗可以达到预防瘢痕疙瘩复发的目的[14]。Sakamoto等[7]指出瘢痕疙瘩术后生物学有效剂量(BED)为20 Gy，分5次治疗后复发率为11%，认为瘢痕疙瘩复发率与BED呈剂量-效应关系。Flickinger等[15]指出身体其他部位病变电子辐射剂量高于耳垂瘢痕疙瘩，且表明短疗程、高分割剂量是防止复发的最佳策略。本研究采用一个特定总剂量(15 Gy)不同时间间隔(1～7 d)对HKF进行浅层X射线照射。Ⅰ型胶原是真皮细胞外基质(extracellular matrix, ECM)主要成分，当皮肤受伤或真皮修复期间，Ⅲ型胶原蛋白含量会暂时增加，延迟上调TGF-β3以及降低Ⅰ型胶原蛋白表达[16]。本研究在不同间隔的各组经3次连续照射后，HKF内胶原分泌均较前减少，且间隔前3 d对细胞外上清中Ⅰ型胶原蛋白分泌水平均有显著抑制作用(P<0.01)。而Ⅰ型胶原蛋白/Ⅲ型胶原蛋白比值在第1～3天随时间间隔逐渐增高，第3天达最高水平(P<0.01)。以上结果共同提示照射间隔控制在3 d内，浅层X射线对HKF胶原蛋白的表达具有显著影响。近期关于瘢痕疙瘩术后放射治疗时机的Meta分析也总结了瘢痕疙瘩切除术后72 h内放射治疗疗效优于72 h后放射治疗疗效的结论[17]。X射线辐射可通过控制成纤维细胞增殖，阻止细胞周期并诱导细胞过早衰老来防止瘢痕疙瘩复发[18]。另外，细胞的无限增殖受关键调节点G1、G2及S期调控，间隔放射疗法给予了细胞修复的时间，调节细胞周期G1期向S期转换[19]。周期蛋白D/CDK4磷酸化Rb使p53激活，可抑制周期蛋白E/CDK2，使周期停止，控制细胞循环，抑制细胞增殖[20]。本实验结果提示间隔1～3 d浅层X射线照射后可能存在使细胞损伤停留在不同阶段如G1/S期、G2/M期，或使处于相对抗拒放射时相的细胞向放射敏感时相移动的再分布现象。

瘢痕疙瘩的形成是胶原不断沉积的结果，局部微环境除了可通过自身DNA序列改变之外，还可通过表观遗传学改变DNA甲基化转移酶及非编码RNA影响瘢痕疙瘩成纤维细胞Wnt/β-连环蛋白信号通路和胶原蛋白的表达[21]。一些文献报道瘢痕疙瘩皮损及成纤维细胞p16基因低表达，辐射能诱导DNA甲基化模式发生改变和细胞周期相关基因p16、p21、p27 mRNA和蛋白水平明显升高[22]，但具体通过特定基因启动子CpG岛甲基化状态及何种途径，目前尚不清楚。本实验通过细胞学体外实验研究表明，浅层X射线可通过影响HKF胶原蛋白分泌周期抑制胶原产生，结合Pogribny等[23]研究发现不同剂量X射线辐照HKF后出现衰老表型特征，DNA甲基化转移酶mRNA表达水平降低，推测浅层X射线治疗瘢痕疙瘩疗效可能归因于对HKF表观遗传学影响。本研究通过实时定量PCR和Western blot结果比较浅层X射线照射后HKFⅠ型胶原蛋白/Ⅲ型胶原蛋白比值，当两次分割剂量时间间隔延长至4～7 d时，浅层X射线对成纤维细胞的胶原蛋白分泌作用在间隔5 d和间隔7 d出现回升趋势，可能由于细胞分裂或再群体化，导致细胞增殖和胶原蛋白产生增加。为进一步证实不同时间间隔浅层X射线照射后细胞外胶原蛋白表达的影响，本研究利用ELISA实验检测培养基上清胶原蛋白含量，结果表明1～3 d和4～6 d胶原蛋白抑制率逐渐升高，可能存在浅层X射线照射后胶原蛋白最适抑制周期。瘢痕疙瘩除了通过COL1A1信号通路影响HKF的形成和凋亡，还受到缺氧环境等复杂微环境的影响，因此进一步探讨浅层X射线照射对细胞分裂周期相关蛋白及表观遗传学改变的影响，可能是本课题未来的研究方向。

综上所述，本研究证明了浅层X射线对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和胶原分泌的抑制作用，推测高张力部位需给予足够大的辐射剂量，且照射间隔控制在3 d内对预防瘢痕疙瘩复发具有重要意义，随着间隔时间延长，胶原蛋白分泌出现回升趋势，但确切的分子机制还有待深入研究，最佳放射治疗间隔周期还需结合临床综合评估。