二月兰对铜污染的耐受与富集分析

姜胜行， 刘一博， 李威， 郑思， 明凤，*

二月兰对铜污染的耐受与富集分析

姜胜行1†， 刘一博2†， 李威1， 郑思2， 明凤1，*

（1.上海师范大学 生命科学学院，上海 200234； 2.上海中学，上海 200237）

为探究十字花科植物二月兰对土壤中铜离子的吸收和耐受性，采用不同浓度的硫酸铜溶液对其种子萌发阶段和生长阶段进行处理，测定了二月兰的生理指标.结果表明：铜离子溶液处理15 d后会对二月兰的萌发率产生影响.当铜离子质量分数为35，100 mg∙kg-1时，均能促进二月兰种子的萌发，而400 mg∙kg-1处理组则导致萌发率显著下降，发芽率仅为对照组的41％；土壤栽培处理，35，100 mg∙kg-1均能促进二月兰生长，而400 mg∙kg-1处理组则导致生长幅度减小，叶片数量和株高也显著少于前两组实验.同时，400 mg∙kg-1处理组导致超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）的活性提高，铜离子对二月兰造成一定生长胁迫.铜离子转运系数和富集系数分别为0.56和0.52，说明二月兰对铜离子的富集能力表现优良，尚未造成毒害.进一步分析铜离子转运相关基因的表达，外源施加铜离子，导致体内基因表达量相对于对照组显著降低. 本研究揭示了二月兰对于土壤中铜离子污染具有吸收和富集作用，为治理土壤中铜离子污染提供了理论依据，并证明二月兰可作为优良的富集植物.

二月兰； 铜离子胁迫； 富集； 生理指标分析

0 引 言

2014年国家环保部与国土资源部发布信息显示，我国的土壤无机污染物超标达82.8％，其中铜离子污染占比2.1％［1］.据调查，长三角地区超过10％的农田几乎失去了种植作物的能力［2］.对南京市江宁乡某地的调查显示：重金属含量在局部地区已经到达警戒范围［3］，其中华东长三角地区的老矿业区、工业区的土壤重金属离子污染严重，许多废弃矿业区已经不适合植物的生长.铜离子的毒害性很强，摄入过量会导致植物体紊乱，使植物出现萎蔫等状态，影响其生长发育及产量［4］.它的毒性还与癌症、神经退行性疾病有关联，通过食物链进入人体后还会危害人类健康［5］.另外，过量的铜离子摄入还会导致细胞破裂和死亡，影响机体代谢［6］.

对于土壤中重金属离子的治理方法目前主要分为4类：物理、化学、生物和生物技术方法［7］.其中生物修复土壤污染方法包括动物修复、微生物修复和植物修复［8］.植物修复法，即选用富集能力强的植物来吸收土壤中对应的重金属，这样不仅不会破坏生态环境，且治理成本也低，是目前最具应用前景的方法. 目前对于超富集植物的筛选和判断标准已经趋于成熟，主要通过转运系数、富集系数以及地上部分积累值标准三方面进行综合判断.有研究证明种植苎麻、圆叶遏蓝菜等植物可富集土壤中的重金属，从而改善土壤环境［9］.植物修复法目前的难点在于植物生长周期长，导致治理效率低下；另一方面，耐金属的植物品种仍然不多，导致种植密度并不理想.因此，探究和筛选出生长周期短、富集污染物效率高的植物是生态学者们的研究热点.

诸葛菜（）属十字花科，别名二月兰，是1年或2年生的草本植物，在农历二月前后开花，花瓣呈蓝紫色或淡红色，常被作为林下种植植物.其适应性、耐寒性强，对土壤的要求不高，即使在寒冷的冬季也依旧可以保持郁郁葱葱.本研究选取二月兰作为目标植物，在不同浓度铜离子溶液处理下，对其萌发率、叶片数和株高进行了观测，通过测量叶片相对电导率了解植物膜系统状况，通过二氨基联苯胺（DAB）、氯化硝基四氮唑蓝（NBT）染色法揭示二月兰叶片活性氧代谢程度等生长过程中的相关生理生化指标，并测定最终的铜离子转运系数和富集系数，为二月兰作为能富集铜离子的功能性观赏植物的可能提供了理论参考.

1 材料与方法

1.1　材料与试剂

植物材料为二月兰种子（绿景园种业，江苏宿迁）；生化试剂包括硫酸铜、NBT、DAB、甘油.

1.2　仪器与设备

分析天平、直尺、电导仪、荧光定量聚合酶链式反应（PCR）仪器、玻璃平皿、10 mL注射器；FR-250系列电泳仪，上海复日科技有限公司；GenoSens 1850凝胶成像仪，上海勤翔科学仪器有限公司；Biometra Tone 96G PCR反应仪，德国Biometra GmbH/Analytik Jena AG.

1.3　方 法

1.3.1实验分组及处理

本实验选取常规的二月兰种子，在加入不同浓度梯度硫酸铜溶液的玻璃皿中生长，为了溶液分布均匀，将灭菌的滤纸覆盖在平皿上，种子均匀播撒.

表1　硫酸铜熔液配方

实验设计4个处理组（表1），以去离子水为对照（CK）种子播撒完成后，用封口膜将玻璃皿封住，每个处理组梯度重复3个，于恒温25 ℃培养室内培养，每3 d加一次处理液.

种子萌发后进行萌发率测定，并将萌发的种子移栽至配置好的营养土中进行生长.此后，每3 d进行一次处理，加入等量不同浓度的硫酸铜溶液.

1.3.2理化指标的测定

1） 二月兰叶片数及生长高度的测量：培养期间，每7 d使用直尺，于下午5时测定每棵幼苗的高度和叶片数.

2） 叶片相对电导率采用抽气法测定：用打孔器取3片大小一致的二月兰叶片作为一组，每个样品重复3组，加入10 mL双蒸水（dd H2O）抽真空，使叶片全部浸没在水中；摇床轻摇4 h，用电导率仪测量煮前电导率1；沸水浴20 min，冷却至室温后，测量煮后电导率2.相对电导率为1/2×100%.

3） 过氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）活性检测：POD活性采用DAB染色法测定，SOD 活性采用NBT染色法测定.在各硫酸铜溶液浓度梯度处理的样品中随机取3片叶片，加入各自染液，沸水浴加热5 min，暗处静置16 h染色，倒出染液，用清水冲洗样品2～3次，加入无水乙醇，水浴加热5 min，倒去乙醇，重复至脱色，加入甘油溶液（体积分数为40%）保存，暗处静置2 h，取出叶片样品，吸干甘油后进行观察.

4） 叶绿素含量检测：将二月兰叶片称取同等的0.3 g，浸没在提取液（体积分数70%丙酮+20%乙醇+10%水）中，4 ℃轻摇过夜，利用分光光度计分别在663 nm和645 nm下，测定吸光度663和645，叶绿素质量浓度（单位mg∙L-1）测定方法为：

Chla=12.7663-2.69645，

Chlb=22.9645-4.68663，

Chl=Chla+Chlb=20.21645+8.02663，

其中，Chla，Chlb，Chl分别为叶绿素a、叶绿素b和叶绿素的质量浓度.

表2　qPCR引物

5） 植物铜离子结合相关基因（）实时荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）测定：取各样品叶片，用艾科瑞生物公司的植物RNA提取试剂盒提RNA，定量反转录cDNA，根据拟南芥同源基因设计定量引物和内参基因引物（actin），各设计3对引物进行点样qPCR，分析qPCR数据.选取引物如表2所示.

1.3.3数据处理

用Excel进行数据整理与分析，用Graphpad Prism9制图，采用Student’s-test进行单因素方差分析.

2 结果分析

2.1　不同浓度铜离子溶液对二月兰萌发率的影响

将采购的种子在含不同浓度铜离子溶液的玻璃皿中培养，培养期间每3 d补一次溶液，并在第15天拍照（图1（a）～1（d））和测定萌发率（图1（e）～1（f））.

图1　不同浓度铜离子处理组对二月兰萌发率的影响.

（a） CK，（b） 一级、（c） 二级、（d） 三级铜离子处理15 d的种子萌发照片；（e） 15 d统计发芽率；（f） 萌发率对比柱状图（**表示极显著差异<0.01，=100）

与CK对比，加入不同浓度铜离子溶液处理的二月兰种子萌发率差异很大，一级处理后对萌发效果促进最好，萌发率达70％；二级处理对二月兰的萌发也有促进；三级对萌发效果抑制最明显，萌发率只有23.3％（图1（e），1（f））.该结果表明：铜离子质量分数在35～100 mg∙kg-1之间时，对二月兰的萌发有促进效果，而达到400 mg∙kg-1时会抑制二月兰种子的萌发.

2.2　不同浓度铜离子溶液对二月兰生长状况的影响

二月兰进行盆栽培养，35 d后观察各处理组二月兰株系生长情况（图2）.与CK相比，铜处理7 d后二月兰长势显著变慢，第21天开始三级处理组出现死亡.而二级处理组在7 d后就有显著促进生长现象，这与种子萌发结果相似.随着时间的增长，二级处理组的长势要高于CK，而CK又显著高于三级处理组.

图2　不同浓度铜离子处理组对二月兰生长状况的影响.

（a） 0 d；（b） 7 d；（c） 14 d；（d） 21 d；（e） 28 d；（f） 35 d

土壤栽培期间，进行生长期各处理组株系的株高、叶片数、叶片状态、死亡率指标测定（图3）.随着种植时间的延长，二级处理组的叶片数以及状态与株高均高于三级处理组（图3（a），3（b），3（d）），且高于CK.而只有三级处理死亡率为16.7％，远高于CK和二级处理组（图3（c）），说明三级处理组对于铜离子的耐受性低.实验结果表明：适量浓度的铜离子可以促进二月兰生长，而浓度过高又会显著抑制二月兰生长.

图3　不同处理时间进行（a） 叶片数、（b） 株高的统计及处理30 d后的（c） 死亡率及（d） 单株叶片数取样观察（*代表显著差异p<0.05，n=6）

2.3　二月兰生长过程中活性氧代谢和相关指标的鉴定

叶绿素含量与植物生长状态成正比，通过检测土壤中生长35 d后的二月兰叶绿素含量，可知二级处理组叶绿素含量最高，CK含量最低，而三级处理组介于两者之间（图4（a）），说明铜处理并没有抑制二月兰体内叶绿素的合成.在逆境之下植物膜系统会损伤，细胞液外流，因此相对电导率能够反映植物体内膜系统的状况.本实验中，三级处理组相对电导率增加，而二级处理组几乎与CK无差别，综合实验结果可知：三级处理组虽然受到铜离子胁迫严重，但相对电导率略有增加，说明细胞膜系统受损较轻，能在吸收和富集铜离子的过程中起作用（图4（b））.采用DAB和NBT染液进行染色，验证POD与SOD的积累，过氧化氢可以直接或间接地反映植物细胞受到损害的程度，植物细胞受到损害越严重，DAB染色后棕色物质积累越多.本实验中叶片细胞受损最严重的是三级处理组，其次是二级处理组，CK组无损伤（图4（c）），表明在二级和三级两个不同铜离子浓度处理下，叶片中POD的活性降低.另外，SOD可清除植物体内O2-的积累，经过NBT染色后，样品颜色呈现蓝色越明显，则说明酶活性越低.三级处理组的叶片边缘有些许蓝色累积（图4（d）），而二级和CK都没有蓝色累积，说明三级处理导致SOD些许积累.研究表明：经过不同浓度梯度铜离子处理后，高浓度处理会对二月兰叶片造成些许损伤，但整体影响不大，进一步说明二月兰可以在对铜离子的吸收和富集过程中起作用.

图4　铜离子胁迫处理后二月兰叶片相关指标测量.

（a） 叶绿素含量；（b） 相对电导率；（c） DAB染色；（d） NBT染色（*<0.05，**<0.01，=3）

2.4　二月兰耐受铜离子胁迫的机理探究

在用铜离子溶液处理85 d后（图5），相比二级处理组，三级处理组的生长状况明显较差，且死亡率达到50%，说明高浓度铜处理对二月兰的伤害性最强.

图5　处理85 d植株表型整体观.（a） CK；（b） 二级；（c） 三级

用铜离子溶液处理85 d后，3个实验组都改用自来水灌溉，继续培养15 d，最后对二月兰植株进行取样，测定各类指标和含量（图6）.由图6（b）可知，根系质量随着铜离子浓度的增加而减少；根系长度在二级有所增加，但三级又减少；株高也随浓度增加有比较明显的降低趋势.

图6　培养100 d后根部表型以及指标分析.

（a） 根系表型；（b） 根系质量；（c） 根系长度；（d） 株高（*<0.05，**<0.01，***<0.001，=3）

二月兰中的序列与拟南芥中基本一致，因此利用其进行表达量测定.与CK相比，二级和三级处理组的表达量大幅度下降，差异显著，说明施加铜离子溶液之后，二月兰体内的COPT1蛋白对Cu+进行了转运.对二月兰的地下和土壤两部分进行铜离子含量的检测（图7（a），7（b））可以看出各处理组地下部分铜离子含量远高于CK，而施加更高浓度的三级处理组土壤中的铜离子含量与二级处理组含量无显著差异，说明二月兰对铜离子的吸收和富集能力有优势，且在高浓度的情况下吸收效果更好. 三级处理组对铜离子转运系数和富集系数分别为0.22和0.52（CK处理组分别为0.17和0.56），说明对铜离子的富集浓度随外源铜离子处理浓度增加而增加，污染浓度达到国家标准三级时满足重金属富集优良植物标准.这些结果也进一步说明二月兰植株可以作为吸收和富集铜离子的优良品种.

图7　培养100 d后二月兰中铜含量测定以及相关系数分析.

（a） 根部；（b） 地上部分；（c）的相对表达量（*<0.05，**<0.01，***<0.001，=3）

3 讨 论

铜离子过量对植物生长有显著的抑制作用，根系质量则随浓度增加而减轻.由于铜离子属于无机盐微量元素的一种，植株适量吸收接触铜离子后，其会参与协助植株体内各项机理，或会促进植物生长素的分泌，对营养成分的吸收利用等其他生化过程有所帮助，根系长度的增加证明了这一点.研究中还发现，叶绿素含量在铜离子胁迫下均相较CK有所上升.少量的铜离子可以促进植物体内相关酶的合成，促进植物生长，可能是部分铜离子转运到叶片中，促进了叶绿素相关合成酶的表达，从而导致叶绿素含量上升［10］.

拟南芥COPT1基因主要在根尖等部位表达，对Cu+具有较高亲和力，当Cu2+被ZIP蛋白吸收或被FRO还原为Cu+时，Cu+通过COPT1蛋白转运进入细胞质，且其表达受Cu负调控［11］，拟南芥和二月兰同为十字花科植物，且二月兰没有基因组.利用拟南芥中COPT1和actin作为模板设计定量引物并送测序，发现二月兰中的序列与拟南芥中一致，因此使用其引物进行定量检测，结果与之前的研究一致，在处理组中的表达量显著降低（图7（c）），说明二月兰对土壤中的铜离子进行了富集和吸收.对于二月兰富集特性，可能与COPT1基因表达下调有关，具体分子机理需要深入研究.

在生长过程中，二月兰植株生长状况和抗病能力也随之减弱，尤其是二级处理组，由于病虫害问题，导致地上部分萎蔫，所以在测定铜离子转运系数和富集系数时，只做了CK和三级处理组的地上部分. 也许是二级处理植物富集一定的铜离子而影响其免疫能力，这一点值得进一步探究.结果证明：二月兰在铜离子浓度达到国家三级标准时能够起到富集作用，但其生长状况也受到较大影响.而在一级、二级标准下生长萌发情况较好，可以与其他超富集植物混种，或用作污染土地造景植物，美化城市环境.

4 结 论

本实验以国家不同标准浓度的铜离子溶液为处理剂，对二月兰进行处理，观察分析了二月兰各项生长指标，证明二月兰对铜离子吸收和富集作用显著.二月兰在国家三级污染标准下（400 mg∙kg-1）对铜离子的富集系数和转运系数分别为0.22和0.52，说明二月兰可作为优良富集植物对土壤中的重金属污染物进行富集.

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Analysis of the tolerance and enrichment of copper pollution in

JIANGShenghang1†， LIUYibo2†， LIWei1， ZHENGSi2， MINGFeng1*

（1.College of Life Sciences， Shanghai Normal University， Shanghai 200234， China； 2.Shanghai High School， Shanghai 200237， China）

In order to explore the absorption and tolerance of the bronze ions of Cruciferous plantin the soil，the copper chloride solutions with different concentration gradients are treated on the’s seeds and its plantlets during different development phases，and the physiological indexes ofwere determined. The results showed that after 15 d of different concentration copper ion solutions，the germination rate ofwas affected. The mass fraction of copper ion 35，100 mg∙kg-1can promote the germination ofrespectively，while the 400 mg∙kg-1treatment group leads to a significant decrease in germination rate，the germination rate is only 41% of the control group. Soil cultivation treatment for35，100 mg∙kg-1can promote their growth，while 400 mg∙kg-1treatment group leads to decline in growth. And the number of blades and plants are also significantly less than the first two experimental groups. At the same time，the 400 mg∙kg-1treatment group caused the activity of superoxide dismutase（SOD） and peroxidase （POD） increased，thus copper ions caused certain growth stress on. The copper ion transport coefficient and the enrichment coefficient are 0.56 and 0.52，respectively，indicating that the enrichment of copper ions on copper ions is excellent，and has not been poisoned. Further analysis of the expression of copper ion transshipment related genes，exogenous application of copper ions，resulting in significant decreasesgene expression relative to the control group. This study revealed that thehas abilities of absorption and enrichment on the copper ion pollutions in soil，which providing theoretical basis for the removing copper ion pollutions from soil and the recommendation guiding significance of enriching plants.

； copper ion stress； enrichment； analysis of physiological indicators

10.3969/J.ISSN.1000-5137.2022.04.013

2021-11-23

上海市地方院校能力建设专项项目（20070502500）； 上海植物种质资源工程技术研究中心项目（17DZ2252700）

姜胜行（1996—）， 男， 硕士研究生， 主要从事植物学方面的研究. E-mail： jiangshenghangzjd@163.com

明 凤（1971—）， 女， 教授， 主要从事植物非生物逆境遗传学方面的研究. E-mail： fming@fudan.edu.cn

姜胜行， 刘一博， 李威， 等. 二月兰对铜污染的耐受与富集分析 ［J］. 上海师范大学学报（自然科学版），2022，51（4）：483‒491.

JIANG S H， LIU Y B， LI W， et al. Analysis of the tolerance and enrichment of copper pollution in［J］. Journal of Shanghai Normal University（Natural Sciences）， 2022，51（4）：483‒491.

Q 945

A

1000-5137（2022）04-0483-09

刘一博提出研究思路， 姜胜行设计研究方案， 姜胜行、 刘一博共同进行实验， 共同撰写论文； 姜胜行完成文章整理与修改.二人共同完成本论文， 因此并列为第一作者.

（责任编辑：顾浩然）