血清miR-215和miR-34a表达水平与非小细胞肺癌患者术后复发或转移的关系*

李敏, 李海新△, 陈艳红, 冯丽娟, 张雪阳, 杨谦

邯郸市中心医院 1检验科， 2胸外科(河北邯郸 056000)

肺癌为一种常见恶性肿瘤，也是癌症死亡的主要原因，其发病率和病死率分别占我国全部恶性肿瘤的13%和18%[1]。非小细胞肺癌(non small cell lung cancer，NSCLC)约占肺癌病例的80%，有着高发病率、预后差及高病死率等特点[2]，NSCLC术后死亡的主要因素为复发和转移[3]，而微小核糖核酸(microRNA，miR)与恶性肿瘤复发或转移关系密切[4]。miR-215为新近发现的微小RNA之一，在肿瘤细胞增殖、凋亡、周期调控中发挥重要作用，如胃癌[5]、肝内胆管癌[6]。miR-34a与血管生成相关，且在多种恶性肿瘤中异常表达并发挥重要作用，如结肠癌[7]、肝癌[8]等。相关报道已证实，miR-34a、miR-215分别在结直肠癌和卵巢上皮性癌复发或转移中发挥一定作用[9-10]，但其与NSCLC复发或转移的关联性尚不清楚。为了解血清miR-215和miR-34a表达水平与NSCLC患者复发或转移的关系，本次研究对此展开分析，旨在为今后临床治疗NSCLC提供有效的参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018年1月至2019年5月在我院确诊并治疗的NSCLC患者113例，根据随访期间是否发生复发或转移分为无复发或转移组(n=54)和复发或转移组(n=59)，无复发或转移组：男31例，女23例；年龄40～73岁，平均(62.23±5.12)岁；吸烟31例；肿瘤分化程度：中高分化38例，低分化16例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期39例，Ⅲa期 15例；肿瘤部位：左肺22例，右肺32例；肿瘤病理类型：腺癌27例，鳞癌27例。复发或转移组：男36例，女23例；年龄42～74岁，平均(63.11±5.48)岁；吸烟37例；肿瘤分化程度：中高分化27例，低分化32例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期30例，Ⅲa期 29例；肿瘤部位：左肺25例，右肺34例；肿瘤病理类型：腺癌33例，鳞癌26例。同期收集113例体检健康志愿者为对照组，其中男70例，女43例；年龄41～75岁，平均(63.33±5.46)岁；吸烟64例。3组对象间性别、年龄、吸烟情况比较差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经本院伦理委员会批准[伦(审)A20180107-1]。

入选标准：(1)符合《中华医学会肺癌临床诊疗指南(2018版)》中相关诊断标准[11]，经穿刺活检病理确诊，为原发病灶；(2)拟行胸腔镜下肺癌根治术；(3)病历资料完整；(4)患者或家属签署知情同意书。

排除标准：(1)合并其他恶性肿瘤；(2)合并严重内分泌疾病；(3)合并精神系统疾病、感染性疾病；(4)合并心、肝、肾及脑等重要脏器疾病；(5)活动性炎症。

剔除标准：随访期间失访。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR法检测血清miR-215和miR-34a表达情况 患者于入院次日清晨(术前)、对照组于体检当天采集空腹时的外周静脉血5 mL于抗凝管内，以3 000 r/min进行高速离心，离心时间为10 min，将上层血清分离，于-80°冰箱中保存。用北京伊塔生物科技有限公司提供的总RNA提取试剂盒(批号YTA220)提取血清内总RNA，用上海研卉生物科技有限公司提供的反转录试剂盒(批号toyobo/FSQ-301)将其反转录成cDNA，以此cDNA为模板进行PCR扩增，预变性95℃/5 min，变性93℃/10 s，退火61℃/30 s，延伸72℃/15 s，40个循环。引物委托上海杏园瑞民生物工程有限公司设计合成。引物序列：miR-215：F:5′-CCTGTGCTGCGAAGTGGAAAC-3′，R:5′-TTCGATCTGCTCCTGGCAGG-3′，miR-34a：F:5′-CATGTAGACCAGGACCTAAGG-3′，R:5′-GGAGGTCGGTACCAGAGTG-3′。以2-ΔΔCt计算标准化后的miR-215和miR-34a表达水平，Ct为循环阈值，内参为GAPDH，ΔΔCt=(Ct目的-Ct内参)-Avg.(Ct目的-Ct内参)。

1.2.2 随访 对本研究中的113例患者行胸腔镜下肺癌根治术后予以电话和门诊复查的方式进行随访，从手术日随访至患者死亡或随访期满，随访期为24个月，每3个月复查1次，内容包括症状、体征、影像学表现等，以二次活检发现新的肿瘤灶或转移灶为复发或转移，记录复发或转移情况。对于随访中遇到不能确定的转移灶，做PET/CT检查进一步核实。

2 结果

2.1 3组血清miR-215、miR-34a表达水平的比较 血清miR-215在复发或转移组中的表达水平显著低于无复发或转移组和对照组，且无复发或转移组低于对照组(P<0.05)。血清miR-34a在复发或转移组中的表达水平显著高于无复发或转移组和对照组，且无复发或转移组高于对照组(P<0.05)。见表1。

表1 3组血清miR-215和miR-34a表达水平

2.2 复发或转移组和无复发或转移组的临床病理参数的比较 复发或转移组和无复发或转移组间性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤病理类型、吸烟情况比较差异无统计学意义(P>0.05)，复发或转移组和无复发或转移组间肿瘤分化程度、TNM分期比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 对比复发或转移组和无复发或转移组的临床病理参数 例(%)

2.3 NSCLC复发或转移的影响因素分析 建立非条件logistic回归模型，以本研究资料为样本，以NSCLC复发或转移状况为应变量，赋值1=复发或转移，0=否。分别进行：(1)单因素分析：自变量指标列示于表3，各指标赋值参见表3。回归结果：肿瘤分化程度为低分化、TNM分期为Ⅲa期、miR-215低表达、miR-34a高表达均可能为NSCLC复发或转移的危险因素(OR>1，P<0.05)。见表3。(2)多因素分析： 自变量为单因素分析中呈现显著的4个指标，赋值参见表4。回归过程采用逐步后退法，以进行自变量的选择和剔除，设定α剔除=0.10，α入选=0.05。回归结果：TNM高分期、肿瘤低分化及miR-215低表达、miR-34a高表达是NSCLC复发或转移的危险因素(OR>1，P<0.05)。见表4。

表4 多因素分析NSCLC复发或转移的影响因素

2.4 ROC曲线分析 进一步对miR-215、miR-34a等二指标进行NSCLC复发或转移的预测评估价值分析，结果显示：(1)各指标的单独应用：以转移复发组为阳性样本(n=59)，以无转移或复发组为阴性样本(n=54)，建立ROC诊断分析模型，两指标均参考临床实践划分成若干个组段，再以软件拟合之ROC曲线读取约登指数最大值点，对应计算理论阈值和各项参数。并按实测样本计算敏感度、特异度、准确度。经ROC分析知：该两指标具有较高的诊断价值，AUC分别为0.723、0.750。(2)各指标的联合应用：参考SPSS软件的联合应用之理论Log(P)模式，基于回归预测模型结果，将各单独应用指标的回归系数B作为计分参数，归一化加权计算并对应处理各样本资料，据以进行联合应用的ROC分析和制作ROC分析曲线。结果：对miR-215、miR-34a联合应用对NSCLC复发或转移的预测评估价值：AUC(95%CI)为0.835(0.704～0.965)，准确度为0.845(98/116)。

表5 血清miR-215和miR-34a预测NSCLC复发或转移的价值

图1 miR-215和miR-34a预测NSCLC复发或转移的ROC曲线

3 讨论

NSCLC约占全部肺癌的80%，75%左右的患者发现并确诊时已处于疾病中晚期，失去手术治疗机会。然而，即便早期患者进行手术治疗仍具有较高复发或转移风险，严重影响患者生存质量[12]。因此，深入研究NSCLC的复发或转移机制并探寻有效干预治疗靶点，进而实现对该病治疗的突破，为目前诸多学者研究的焦点。

肿瘤分子标志物的血清水平通常与癌症的发生、病情发展、癌灶消退、复发等有着一定程度的相关性，因而测定肿瘤标志物血清水平对于获得恶性肿瘤的早期诊断、治疗疗效及预后情况等方面信息有着重要意义[13]。肺癌肿瘤标志物在肺癌诊断的临床应用方面有一定意义，但尚未找到高敏感性和特异性单一肺癌标志物。近年来各报道显示[14-15]，近50%以上的miRNA定位于和肿瘤有关的染色体上，提示miRNA分子与肿瘤发生及病情发展相关。肿瘤引起的miRNA分子表达水平改变，能特异地反映在机体外周血中，故而可作为肿瘤早期诊断和预后评估的血清标志物[16-17]。因此，研究miRNA与肺癌的关系有着重要临床指导意义。miRNA是一类长约22 nt的非编码RNA分子，可通过干扰靶mRNA稳定性或翻译效率对机体内基因表达起到负性调控作用[18]。miR-34a为miRNA中的一种，是miR-34家族中的一员，大小为22个碱基，基因定位于1p36.23上，与细胞周期、细胞凋亡等细胞生物学行为关系密切。研究显示miR-34a能够负向调控Notch1 mRNA和蛋白表达水平，发挥阻止MCF-7乳腺癌细胞生长、增殖的效应[19]。另有研究发现[9]，miR-34a是结直肠癌根治术后无病生存期的影响因素之一，能够作为预测结直肠癌根治术患者术后肿瘤复发及肿瘤转移的潜在分子指标之一。有学者通过检测miR-34a在膀胱癌患者中表达情况，发现该分子水平与患者淋巴结转移、临床分期及预后相关[20]。另有研究证实[21]，miR-34a为影响喉癌患者预后的独立因素，并与淋巴结转移相关，可能是喉癌诊治的新靶点。miR-215是一个受p53诱导表达的miRNA，能够调节靶基因表达，该分子亦为miRNA中与肿瘤关系密切的一种，能参与调控肿瘤细胞增殖、转移、耐药等过程，与肿瘤发生、发展及预后显著相关。以往研究显示基因毒性应激可使miR-215水平增加，miR-215水平上调会引起肿瘤细胞周期停滞[22]。既往实验证实用射线照射NSCLC细胞系A549后，基因芯片显示多个microRNA表达出现变化，其中包括miR-215[23]。

本研究发现，NSCLC患者血清中miR-215呈低表达和miR-34a呈高表达，提示上述2个分子可能成为评估 NSCLC发病的肿瘤血清标志物。此外，本研究分析了血清miR-215、miR-34a与NSCLC患者复发或转移的关系，logistic回归模型分析显示除了TNM高分期、肿瘤低分化外，miR-215低表达、miR-34a高表达也是NSCLC复发或转移的危险因素，提示miR-215和miR-34a在NSCLC复发或转移及预后预判中有一定的评估作用。ROC曲线显示，miR-215及miR-34a，联合预测NSCLC复发或转移的AUC、敏感度、特异度及准确度均较高，提示该2指标联合检测应用对于NSCLC复发或转移有较高的预判价值。进一步分析，miR-34a表达可能通过Snail诱导上皮间质转化而促使癌细胞侵袭迁移，继而引发NSCLC复发或转移[24]。既往研究报道[25]，miR-215可通过下调基质金属蛋白酶16(matrix metalloproteinase 16，MMP-16)表达水平而抑制NSCLC细胞系A549增殖和侵袭，反之，miR-215表达减少则会促进A549细胞增殖及迁移，因而推测miR-215低表达可能通过增加MMP-16合成与表达而促使NSCLC复发或转移。

综上所述，miR-215、miR-34a与NSCLC复发或转移密切相关，miR-215低表达与miR-34a高表达为NSCLC复发或转移的危险因素，两者联合检查有助于预测NSCLC复发或转移，这可为今后临床诊治NSCLC提供参考依据，但其具体机制有待进一步明确。

利益相关声明：所有作者声明无利益冲突。

作者贡献说明：李敏、李海新：确定选题、设计实验、实施研究、论文撰写；陈艳红、冯丽娟、张雪阳：数据采集、数据分析、统计学处理；李海新、杨谦：论文审核、项目经费资助。