产前血小板抗体监测对新生儿同种免疫性血小板减少症的预防价值*

阳智芬, 旷开其, 陈洁, 谢毓滨

长沙血液中心输血研究所(湖南长沙 410001)

新生儿同种免疫性血小板减少症(neonatal alloimmune thrombocytopenia，NAIT)是由于胎儿与母亲血小板抗原不一致，母亲产生了针对胎儿的血小板抗体，血小板抗体可通过胎盘进入胎儿体内，从而破坏胎儿血小板，引发一系列的免疫综合征，与新生儿溶血病中红细胞的破坏机制相似[1]。通过对RhD阴性孕产妇IgG抗-D筛查与效价测定来评估发生新生儿溶血病的危险度，加强新生儿溶血病的防治目前已经达成了共识，但是对于RhD阴性人群母婴血小板抗原不合而引起NAIT的研究还相对较少。本研究通过对RhD阴性女性进行血小板抗原及抗体的检测，分析血小板抗体与NAIT发生的相关性，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2017年12月至2020年8月在本血液中心进行产(孕)前免疫学检查的RhD阴性女性的血液标本204例，年龄18～46岁，平均(29±5.6)岁。本研究已通过长沙血液中心伦理委员会批准。

1.2 仪器与试剂 PCR仪(赛默飞世尔科技)、GBOX凝胶成像仪(美国Syngene)、电泳仪(北京六一)、平板离心机(PlateSpinⅡ，日本久保田)、洗板机(瑞士Tecan)、酶标仪(Epoch， 美国Bio Tek)、孵育箱(上海圣科)。

血小板抗体检测试剂盒(长春博德，批号20191005)、PAKPLUS血小板抗体特异性分析试剂盒(美国Immucor 公司，批号3008388)、全血基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技公司，批号S8111)、人类血小板同种抗原HPA1-18，21试剂盒(PCR-SSP法)(天津秀鹏公司，批号K201911004)，LIFECODES LSA 试剂盒(美国Immucor公司，批号3009479)。

1.3 方法

1.3.1 血小板抗体筛查 采用固相凝集法，严格按说明书要求操作，结果判定标准如下，阳性：指示红细胞均匀平铺于反应孔底部表面； 弱阳性： 指示红细胞结合区域大于阴性对照； 阴性： 指示红细胞聚集于反应孔底部中央形成红细胞聚集。

1.3.2 血小板抗体特异性分析 采用ELISA方法进行血小板抗体特异性分析，严格按照说明书步骤操作，结果判断：Cutoff =NCOD× cutoff Multiplier，OD值≥Cutoff 值则判为阳性。

1.3.3 HLA特异性抗体检测 利用Luminex平台检测， 严格按LIFECODES LSA 试剂盒说明书操作。

1.3.4 HPA基因分型 采用PCR-SSP法对人类血小板同种抗原进行基因分型，严格按照试剂盒说明书操作。扩增完成后取扩增产物5 μL，在2.5%琼脂糖凝胶中150 V电泳12 min，使用凝胶成像系统观察结果并拍摄成像。

1.4 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件，计数资料采用2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血小板抗体筛查结果 204 例RhD阴性女性中，血小板抗体筛查阳性者29 例，阳性率为14.22%。其中无妊娠史组的阳性率为2.94%，有妊娠史组的阳性率为16.47%，两组阳性率差异有统计学意义(2=4.253，P<0.05)。将有妊娠史的孕产妇分为3组，分别为妊娠次数1次组、2次组和≥3次组，3组阳性率差异无统计学意义(2=1.469，P>0.05)。见表1、2。

表1 妊娠史对RhD阴性女性血小板抗体筛查结果的影响

表2 不同妊娠次数对RhD阴性孕产妇血小板抗体筛查结果的影响

2.2 血小板抗体特异性检测结果 29例血小板抗体阳性者血小板抗体类型分布见表3，9例HPA抗体鉴定结果分布见表4。

表3 29例 RhD阴性女性血小板抗体类型

表4 9例HPA 抗体特异性分布

2.3 HPA基因分型结果 29例血小板抗体筛查阳性者HPA基因型和基因频率分布见表5。结果显示，HPA-3和HPA-15系统的多态性丰富，其他系统以aa为主，ab少见，bb未检出。

表5 血小板抗筛阳性者 HPA1-18，21系统基因型和基因频率分布

2.4 NAIT的发生情况 通过对血小板抗体筛查阳性的孕妇进行产后追踪随访，了解其小孩出生后是否出现血小板计数<150×109·L-1，是否有皮肤黏膜出现瘀点、瘀斑等血小板减少的临床症状，其中有1例血小板抗体阳性的孕妇，其血清经血小板特异性抗体检测分析，结果为HPA特异性抗体阴性，HLA抗体阳性。经luminex进一步的免疫抗体分析，结果显示该抗体为抗HLA-B60抗体和HLA-Cw7抗体。其胎儿出生后3次血小板计数均小于100×109·L-1，证实其发生了NAIT并及时对症治疗。

3 讨论

本研究共完成了204例RhD阴性女性的血小板抗体筛查，其中阳性29例，阳性率为14.22%。血小板抗体的产生机制分为两种，一种是同种免疫因素，胎儿含有母亲缺乏的血小板抗原，可刺激母体产生抗血小板抗体，此IgG性质的抗体可通过胎盘，一般第一胎不发病，再次妊娠时易发生NAIT；另一种是自身免疫因素，母亲患有自身免疫性疾病，母亲体内已经产生的抗血小板抗体在妊娠期间可通过胎盘进入胎儿体内，与胎儿血小板结合，导致血小板减少，这种在第一胎时就可以发病[2]。本研究中，无妊娠史组中有1例阳性，进一步分析为抗-GP Ⅰa/Ⅱa抗体，该检测者也无输血史，可能为血小板自身抗体。

本研究中有妊娠史的阳性率为16.47%，有妊娠史组阳性率高于无孕产史组，差异有统计学意义(P<0.05)。叶水文等[3]报道初产妇组和经产妇组血小板血型抗体阳性率分别为5.6%和12.3%，两组差异有统计学意义(P<0.05)，无早期流产组和有早期流产组血小板抗体阳性分别为6.8%和11.4%。其他多个研究也表明血小板抗体和妊娠次数及早期流产次数及孕周密切相关，与年龄和分娩方式无关[3-7]。金琪等[7]的研究发现，妊娠次数为1次的孕妇血小板抗体阳性率为4.9%，妊娠2～3次的阳性率为12.6%，妊娠>3次的阳性率高达31.3%，随着妊娠次数的增加，血小板抗体产生的概率也增加。而本研究中不同妊娠次数组之间血小板抗体阳性率差异无统计学意义(P>0.05)，可能原因为孕产妇未如实填写妊娠史，尤其是流产史，提示我们在采集孕产妇的信息时需要进一步引导和规范。张文丽等[8]的研究表明血小板抗体阳性的孕妇主要分布在前置胎盘、瘢痕子宫、胎盘植入、血小板减少症等疾病中。总之，输血史、生育史、疾病类型对于孕妇血小板抗体阳性率均有一定的影响。

血小板抗体主要分为两种，一种是针对血小板特异性抗原的抗-HPA抗体，一种是针对HLA-Ⅰ类抗原的抗-HLA抗体，本研究发现29例阳性者中抗-HLA抗体20例(68.97%)，抗-HPA 4例(13.79%)，抗-HLA抗体和抗-HPA 抗体均阳性者5例(17.24%)，任明等[9]报道的血液病患者血小板抗体特性分析结果为抗-HLA 类60.00%，抗-HPA 2.61%，抗-HLA类和抗-HPA 37.39%，该研究与本研究的结果一致，均表明血小板抗体以抗-HLA抗体为主。

血小板抗体可导致血小板输注无效，输血后紫癜和NAIT。NAIT是导致新生儿血小板减少症的最常见病因，严重时可出现颅内出血[10-11]，在已报道的NAIT病例中，大多数是由HPA抗体所致，在高加索人群中，75%～85%的NAIT是由抗-HPA-1a引起的，在日本引起NAIT最常见的抗体是HPA-5b，其次为HPA-4b[12]。目前国内仅有关于由HPA-5b[13]、HPA-3a[14]等抗体所致NAIT的个例报道，尚无基于大数据分析的关于引起 NAIT的HPA抗体分型的研究。本研究中HPA基因分型结果显示HPA-3和HPA-15系统具有多态性，可能是导致母婴血小板特异性抗原不合的主要因素，但仍需进一步研究验证。随着研究的深入，HLA抗体引起的NAIT被相继报道，邓晶等[15]分析了4例与母源性HLA 抗体相关的NAIT，可能的HLA抗体为-HLA-A11、-HLA-A2、-HLA-B40、-HLA-B15、-HLA-B7和-HLA-B27。本研究发现1例NAIT，患儿母亲血小板计数正常，血小板抗体检测阳性，经鉴定为针对患儿的抗-HLA 类抗体，HLA基因测序结果显示，患儿HLA-A* 24:02、B* 40:01和C* 07:02为遗传自父亲的等位基因，其对应的抗原分别为A24、B60和Cw7，这3种HLA抗原有可能会刺激母体产生相应抗体。HLA抗体特异性分析结果显示，A24抗体未检出，B60和Cw7抗体呈强阳性。因此结合HLA抗体检测和基因分型结果可确定该病例为由HLA-B60抗体和HLA-Cw7抗体引起的NAIT[16]。患儿血小板抗体筛查结果为阴性，可能是由于患儿体内大多数血小板抗体已与自身血小板结合，血清中游离的血小板抗体浓度较低，因此血小板抗体筛查呈阴性。患儿出生后3次血小板计数均小于100×109·L-1，出生时无瘀点瘀斑。

随着二胎及三胎政策的开放，RhD阴性孕产妇这个特殊群体的孕产安全得到了更加广泛的关注，产前免疫学检测越发重要，目前红细胞血型、不规则抗体筛查及鉴定、血型抗体效价检测等已成为产前检查的常规项目，而血小板抗体筛查与鉴定还未得到充分重视。血小板检测专家共识[17]中指出，可疑NAIT妊娠患者应进行血小板抗体检测。因此，通过对孕妇，尤其是有多次妊娠史和流产史的经产妇进行血小板抗体及效价，可为NAIT的预防、诊断和治疗提供一定的依据，从而实现优生优育，提高人口出生素质。

利益相关声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献说明：阳智芬负责主持、项目设计与实施，并负责论文撰写；谢毓滨负责项目设计、项目协调；旷开其、陈洁负责项目实施。