水稻叶和籽粒镉积累机制及QTL定位研究

2022-09-14黄婧朱亮薛蓬勃付强

生物技术通报 2022年8期

黄婧朱亮，2 薛蓬勃，2 付强

（1. 广西大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，南宁 530004；2. 广西大学生命科学与技术学院，南宁 530004）

镉（cadmium，Cd）是生物毒性最强的重金属之一，低剂量（0.1-1 mg/kg）即抑制动植物的生长繁殖［1］。随着工业化的发展，我国受镉、砷、铅等重金属污染的耕地面积近2 000万hm2，约占耕地总面积的20%，每年生产镉含量超标的农产品达14.6亿kg，且有逐渐加重的趋势［2］。水稻（Oryza sativaL.）是世界上约一半人口的主食，稻米是很多国家饮食中摄取镉的最主要来源［3］。镉在人体内积累不易排出，且半衰期长，对肾脏、肝脏和骨骼等造成危害，甚至引起癌症［4］。因此，选育籽粒低镉积累的水稻品种，最大限度减少镉摄入量，对于保障粮食安全和人类健康具有重要意义［5］。

镉在植物体内的分布是一个由根质膜转运蛋白介导的根吸收、木质部装载和卸载，以及韧皮部装载和卸载所共同控制的连续的动力学过程［6］。水稻Cd积累相关性状属数量性状，遗传机制复杂，同时受环境因素影响。不同基因型的水稻地上部分和籽粒中Cd的含量存在很大的差异，这为研究水稻低Cd积累的生理和遗传机制提供了非常有用的种质资源［7］。近年来，已有研究利用不同的低Cd/高Cd水稻品种组合构建的F2、RIL、CSSLs等群体鉴定出不少控制Cd积累的QTL，在水稻12条染色体上均有分布［8-19］。除了OsHMA3［12］、OsCAL1［15］等基因外，上述研究中鉴定的QTL均未克隆到主效基因，关于控制Cd从根到茎转运继而进入籽粒的遗传机制仍不明确，亟待研究。

本研究通过离子组学技术，系统分析中国栽培稻核心种质资源209个品种籽粒的离子谱，鉴定了一批Fe、Zn等籽粒部位高富集以及Cd低积累的水稻品种，为优良品种的筛选和杂交育种提供了种质资源。另一方面，开展水稻Cd积累生理试验和QTL定位分析，为阐明水稻Cd积累遗传机制、运用分子标记辅助选育籽粒Cd含量低而Fe、Zn等营养元素均衡富集的水稻品种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

中国栽培稻（Oryza sativaL.）核心种质资源209份，由上海市农业生物基因中心提供。籼稻花楸03和粳稻SKC为亲本构建DH群体，包含137个株系。

1.2 方法

1.2.1 水稻种质资源籽粒的离子谱测定中国栽培稻核心种质资源的209份，每份随机挑选5粒籽粒至50 mL FalconTM管中，80℃烘箱中，24-48 h。加入5 mL硝酸（MOS级），在 SPB 50-48型石墨消解仪（Perkin Elmer）上进行消解（120℃，30 min）。冷却至室温后，用Milli-Q水定容至50 mL，选取上清10 mL，并用电感耦合等离子质谱仪ICP-MS（ELAN DRC-e，Perkin-Elmer）测量其中14种必需元素和Cd、Pb等有毒重金属元素的含量，计算测量群体的平均值和标准差，最后计算出Z值［Z值=（样本元素浓度-平均值）/标准差］，用以表示样品中某元素含量偏离群体平均值的程度。

1.2.2 水稻的培养条件生理学试验中，SKC和花楸03的种子浸泡于Milli-Q水中，28℃，避光48 h。去除液体，用湿的布巾包裹种子，密封，28℃避光24 h，萌发的种子转入水稻培养液。人工气候箱设置为相对湿度70%，光照周期为13 h光照（温度为28℃）/11 h黑暗（温度为25℃），光照强度80-200 mol/（m2·s）。大田及水槽种植试验区位于广西省南宁市郊的镉污染农田，于当年4月在秧田播种，5月移栽，各株系分别挑选20株长势一致的秧苗移栽，每株系插4行，每行5株。在秧苗生长期间进行常规田间管理，及时除草除虫，注意避免雨天水位上涨淹没秧苗。

1.2.3 生理学试验

1.2.3.1 Cd的耐受性分析对照组和试验组水稻种子萌发后，分别种植于添加了0、0.2、1和5 μmol/L CdCl2的水稻培养液中，并置于人工气候箱培养12 d后，分别选取地上和地下部分材料测量鲜重并进行统计分析。

1.2.3.2 不同试验中的Cd处理条件水稻种子萌发后直接在添加0、0.2、1或5 μmol/L CdCl2的培养液中培养2周，然后取地上部材料，测量水稻叶中Cd的积累。分别以0、0.2、1、5、10或25 μmol/L CdCl2处理两叶一心期苗7 d后，分别对地上部和地下部取材，进行Cd浓度梯度试验。两叶一心期苗经10 μmol/L CdCl2分别处理0、1、2、3、4或5 d后，分别对地上部和地下部取材，进行Cd时间梯度处理试验。两叶一心期苗在正常培养条件（28℃，A）和低温条件（4℃，B）下分别用0、0.2、1、2和5 μmol/L CdCl2处理20 min后，选取根进行根吸收动力学试验。

1.2.3.3 水稻组织中Cd含量的测定按照1.2.3.1和1.2.3.2处理后取材，将水稻地上部和根材料分别用Milli-Q水、CaCl2及Milli-Q水清洗，置于80℃烘箱中，24-48 h。烘干的植物材料，称取10-20 mg至50 mL FalconTM管中。加入5 mL硝酸（MOS级），在石墨消解仪上进行消解（120℃，30 min）。冷却至室温后，用Milli-Q水定容至50 mL，选取上清10 mL，并用ICP-MS测定各组织材料中的Cd含量。

1.2.4 土壤中元素含量的测定在大田及污染、对照水槽土壤中元素含量的测定试验中，采用等间距采样法，共设10个采样点，采集深度为5 cm左右的耕层土壤，自然风干并将土块碾碎后封存。将各点采集的试样混合后，反复按四分法弃取，每个样品设3个重复。每份准确称取0.1 g土壤，采用王水回流法酸解样品，用Milli-Q水定容至50 mL后，选取上清10 mL，并用ICP-MS进行测定。

1.2.5 水稻Cd积累的QTL定位以籼稻花楸03和粳稻SKC为亲本构建包含137个单株的DH群体。对叶中Cd积累进行QTL定位时，将DH群体植株种植于水稻营养液中，并置于人工气候箱培养。两叶一心期苗以10 μmol/L CdCl2处理7 d后取样。每个株系取5个单株的地上部分混收为一份材料，设置4个重复，并用ICP-MS测定Cd含量。对籽粒中Cd积累进行QTL定位时，将DH群体植株种植于Cd污染的水槽土壤中，每个株系种植20个单株。收种后脱粒取谷粒测量Cd含量，每个株系取5个单株，每个单株随机选取10粒谷粒混收为一份材料，设置4个重复，并用ICP-MS测定Cd含量。

利用MAPMARKER/EXP3.0程序［20］进行连锁分析，构建高密度SRR（simple sequence repeat）分子标记连锁图谱，SSR分子标记引物序列信息来源于Gramene网站（www.gramene.org）。结合分子标记连锁图和Cd含量测定结果，利用MAPMAKER/QTL程序［21］进行QTL分析。

2 结果

2.1 水稻核心种质资源籽粒的离子谱

系统分析中国栽培稻核心种质资源209个品种籽粒（见附表）的金属离子谱，鉴定出20余个Cd、Fe、Zn、Mn等含量差异显著的水稻品种（图1）。从中挑选出Cd含量差异显著而Fe、Zn、Mn等含量差异不显著的籼稻品种花楸03（HQ03）和粳稻品种SKC进行后续研究。另一方面，如图2所示，DPS软件统计学分析表明，水稻籽粒中Cd2+与Fe2+、Zn2+、Mn2+无拮抗关系（P>0.05），而Fe2+、Zn2+和Mn2+之间存在极显著的协同关系（P<0.01）。

图1 核心种质资源水稻籽粒中Cd的积累Fig. 1 Profiling of Cd accumulation in grains of rice core germplasm

图2 水稻籽粒中Cd2+、Fe2+、Zn2+和Mn2+元素的相关关系Fig. 2 Correlation among Cd2+, Fe2+, Zn2+ and Mn2+ elements in rice grains

2.2 花楸03与SKC籽粒中的Cd含量的测定

为在同样生境下比较花楸03与SKC籽粒中的Cd含量，将这两个品种分别在受污染大田、Cd污染水槽和对照水槽土壤中种植。如表1所示，土壤中Cd含量高低依次为：污染水槽>大田土壤>对照水槽，Fe、Zn、Cu和As等元素含量在污染水槽和大田中差异不显著。

表1 大田、镉污染水槽和对照水槽土壤中Cd等元素的含量Table 1 Contents of Cd and other metals in the soil of contaminated paddy field，contaminated sink and control sink（μg·g-1 DW）

籽粒中Cd含量高低依次为：污染水槽>大田土壤>对照水槽，与土壤中Cd含量高低的趋势一致（图3-A）。除了对照水槽中两品种的Cd含量均在检测限附近外，其余情况下花楸03籽粒中的Cd含量均显著高于SKC，与图1结果一致（图3-A，P<0.01）。而污染水槽中的花楸03与SKC精米中的Cd含量较低且差异不显著（图3-B，P>0.05）。

图3 花楸03与SKC的籽粒和精米中的Cd含量Fig.3 Cd accumulation in the grains and milled rice of HQ03 and SKC

2.3 花楸03与SKC叶中Cd积累差异显著，而对Cd的耐性和吸收无显著差别

鉴于花楸03与SKC籽粒中Cd积累差异显著，首先检测这两个品种地上部和地下部Cd积累是否也存在差异。种子萌发后直接在添加CdCl2的培养液中生长，叶片中的Cd含量随着CdCl2处理浓度的升高而升高，且花楸03叶中的Cd含量始终显著高于SKC（图4-A，P<0.01）。两者叶中Fe、Zn、Mn等金属元素和K、Mg、Ca等大量元素的含量无显著差异（图4-B、C）。

图4 花楸03与SKC叶片中的元素积累Fig.4 Elements accumulation in the leaves of HQ03 and SKC

对两叶一心期苗分别进行CdCl2浓度梯度和时间梯度的处理，发现叶片中的Cd含量具有浓度梯度和时间梯度的依赖性（图5）。除Cd含量均较低情况外，花楸03叶中的Cd含量始终显著高于SKC（图5-A、B），而根中Cd含量则无显著差异（图5-C、D）。

图5 不同浓度和不同时间CdCl2处理后花楸03和SKC幼苗叶片与根中Cd的积累Fig.5 Cd accumulation in the leaves and roots of HQ03 and SKC from rice seedlings exposed to CdCl2 for indicated concentrations and days

由于两品种叶中Cd积累差异显著，接下来检测它们对Cd的耐受性。种子萌发后直接在添加CdCl2的培养液中生长，对照及不同浓度Cd处理下，花楸03和SKC地上部（图6-A）和地下部（图6-B）的鲜重均无显著差异，说明这两个品种对Cd的耐受性无显著差别。

图6 花楸03与SKC对Cd的耐受性分析Fig. 6 Tolerance assay of HQ03 and SKC to Cd

为明确花楸03与SKC叶中Cd积累差异是由根吸收还是从根向茎的转运差异所导致，对两品种进行了根吸收的动力学研究。如图7所示，无论是在正常培养条件（图7-A）还是低温条件下（图7-B），两品种根吸收Cd的动力学曲线均基本重合，说明花楸03和SKC对Cd的吸收能力无显著差异。

图7 花楸03和SKC的根吸收试验Fig.7 Root uptake assay of HQ03 and SKC

2.4 DH群体的QTL定位

以籼稻花楸03和粳稻SKC为亲本构建了包含137个单株的DH群体，各株系叶和籽粒中的Cd积累量数据呈连续正态分布，表现出数量性状的遗传特点，符合QTL区间的作图要求。共检测到8个控制Cd在水稻叶和籽粒中积累的QTL，分别位于第2、3、4、7、8、10和11染色体上（表2、表3和图8）。

图8 水稻叶和籽粒Cd积累的QTL定位示意图Fig.8 QTLs mapping of Cd accumulation in the rice leaves and grains

表2 水稻叶Cd积累的QTL定位Table 2 Quantitative trait loci（QTLs）mapping for Cd accumulation in rice leaves

表3 水稻籽粒Cd积累的QTL定位Table 3 Quantitative trait loci（QTLs）mapping for Cd accumulation in rice grains

3 讨论

水稻是我国最重要的粮食作物，土壤重金属镉的污染不仅导致水稻生长发育受阻，产量下降，还会在水稻体内大量累积并通过食物链传递，危害国民健康［1，3-5］。因此，研究水稻镉耐受和积累的机制，降低水稻籽粒中Cd含量从而最大限度的减小Cd的摄入量，对于保障粮食安全和人类健康具有重要意义。

不同基因型水稻地上部分和籽粒中Cd的积累存在很大的差异，为研究水稻低Cd积累的生理和遗传机制提供了非常有用的种质资源［9］。利用不同低Cd/高Cd积累水稻组合构建的群体鉴定出不少控制Cd积累的QTL。如Xue等［8］报道了水稻中6个与Cd耐性相关和3个与Cd浓度相关的QTL。Ueno等［9］在第11染色体上鉴定到控制水稻地上部分Cd含量的主效QTL。Ishikawa等［10］将控制水稻籽粒Cd积累的QTL定位到第2和7染色体上，并将其中主效QTLqGCd7定位到第7染色体的短臂上。Hu等［16］利用DH群体定位到18个糙米和14个精米QTL，分别定位于2、3、4、5、7、9和11染色体上。Liu等［17］在第2、3、6、7、8和10染色体上鉴定到7个控制籽粒Cd浓度的QTL。Ueno等［11］利用Nipponbare/Anjana Dhan构建的群体，Miyadate等［12］利用Cho-Ko-Koku/Akita 63构建的群体，先后克隆出根液泡膜上Cd的转运蛋白基因OsHMA3；Luo等［15］利用CJ06/TN1构建的群体，鉴定出控制Cd在叶中积累的防御素类似蛋白CAL1。除此之外，其他研究中鉴定出的QTL均未克隆到主效基因，关于控制Cd从根到茎继而向籽粒中转运的遗传机制仍不明确。

本研究首先利用ICP-MS离子组学高通量分析手段测定了中国栽培稻核心种质资源209个品种籽粒的离子谱，从中鉴定出Fe、Zn等高积累以及Cd低积累的品种20余个，为优良品种的筛选和杂交育种提供了较为详实的参考资料。统计学分析籽粒中各元素的相关关系，发现Fe2+、Zn2+和Mn2+之间存在协同关系，这些元素同属二价重金属，在化学结构上具有很大的相似性，很可能在一定程度上共享植物体内的吸收转运机制。本研究中未观察到Fe2+、Zn2+、Mn2+与Cd2+等重金属元素存在拮抗关系，原因可能在于籽粒中Cd2+、Pb2+等重金属含量较低，且其产地重金属污染状况可能并不一致。

QTL定位的亲本选择对于基因挖掘至关重要，亲本差异越显著越有利于发现更多更稳定的QTL。因此，本研究挑选了Cd含量差异显著的籼稻品种花楸03和粳稻品种SKC作为亲本构建DH群体，并对它们进行了一系列的生理学实验分析。尽管花楸03和SKC对Cd的耐性无显著差异，花楸03叶和籽粒中的Cd含量显著高于SKC。此外，这两个品种精米中的Cd含量均很低且差异不显著，说明Cd在籽粒中可能积累于胚、糊粉层或者颖壳。花楸03和SKC根中的Cd含量以及根吸收动力学研究均表明，它们对Cd的吸收能力不显著。该结果与文献中报道的结果一致，普遍认为木质部介导的根-茎长途转运是决定水稻地上部分和籽粒Cd积累的主要生理过程［22］。而这两个品种籽粒和地上部分中Fe、Zn、Mn等微量元素及K、Mg等大量元素的含量均无显著差异，说明这两个品种Cd积累差异可能与Fe2+、Zn2+等二价阳离子的转运系统无关。因此，利用这两个亲本开展QTL定位对于选育籽粒Cd低积累的优良品种具有重要价值，该过程中基因的鉴定有助于了解控制Cd向地上部分以及籽粒中转运的过程。

DH群体定位共检测到8个控制Cd积累的QTL，分别位于第2、3、4、7、8、10和11染色体上，能解释10.6%-39.4%的表型变异。QTL分析表明，无论是叶还是籽粒中，Cd与Fe、Zn均未参与共定位（数据待发表），与叶和籽粒中Fe等金属元素积累结果相一致。说明这两个品种的Cd积累差异可能与Fe2+、Zn2+等二价阳离子的转运系统无关，暗示控制Cd转运的QTL可能是特异性的。研究发现控制Cd向地上部分和籽粒转运的QTL存在较大差异，推测水稻中这两个过程可能具有不同的调控机制。第2染色体上同时检测到控制Cd向叶和籽粒转运的QTL，在染色体上位置与OsCAL1［15］接近；第7染色体上检测到的QTL与OsHMA3［12］和OsNRAMP5［23］接近；第10染色体上检测到的QTL与Xue等［8］接近。此外，其余4个QTL未见已报道的Cd积累相关基因落在相关区域。其中，第3染色体上检测到的控制Cd向籽粒转运的QTL（qGCd3）定位至RM6266-RM2334的21 cM区间，LOD值（3.81）和贡献率（39.4%）均较高。试验误差、环境影响以及定位群体的背景差异，会造成同一QTL的贡献率及LOD值在不同定位群体中会有所变化。LOD值的变化相对较小，是QTL定位中较为可靠的参数，一般说来LOD值在2以上该位点就有QTL的存在。本研究结果说明此位点QTL存在的可能性很高。但这两个标记之间约21 cM距离，包含近400个基因，需要进一步进行高精确度连锁分析。目前已构建以花楸03为供体亲本，SKC为轮回亲本的片段替换系，拟通过高精确度连锁分析，找到控制镉向水稻籽粒转运的主效基因，解析水稻镉积累的分子机理。