草珊瑚不同提取物抗氧化活性比较研究

杨云成 武文豪 唐守春 王 庆 肖逸飞 李丹丹，3* 王华磊，3

（1贵州大学农学院，贵州贵阳 550025；2贵阳市乌当区农业科技园区建设服务中心，贵州贵阳 550018；3贵州省药用植物繁育与种植重点实验室，贵州贵阳 550025）

自由基是人体组织中一类中间代谢产物，过量时会导致细胞和组织氧化损伤，影响其代谢功能，加速衰老并引发疾病。抗氧化剂主要通过清除体内过多的自由基，防止氧化应激反应对机体组织细胞的损害[1]。作为天然抗氧化剂的植株提取物，因具有毒副作用小、安全性高等优点，已成为研究热点之一[2]。

草珊瑚又名肿节风，属金粟兰科（Chloranthaceae）植物草珊瑚（Sarcandra glabra （Thunb.） Nakai）干燥全草，广泛分布于我国长江以南地区。草珊瑚始载于《本草拾遗》，自1977年以来一直被《中国药典》收录，具有清热凉血、活血消斑、祛风通络的功效，主治血热发斑发疹、风湿痹痛、跌打损伤等症[3]。现代药理学研究表明，草珊瑚具有抗菌、消炎、抗肿瘤、抗病毒及促进骨折愈合等作用[4-6]。经化学成分研究，草珊瑚中主要含有黄酮类、萜类、酚酸类、香豆素类、挥发油类等活性成分[7]。黄明菊等[8]研究发现，不同产地草珊瑚药材均有较好的抗氧化活性，但不同产地间抗氧化活性存在较大差异。针对草珊瑚不同提取物抗氧化活性研究尚未报道。本试验采用不同溶剂提取草珊瑚，并对不同草珊瑚提取物抗氧化活性进行比较，以期为进一步开发利用草珊瑚提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用草珊瑚为2020年采收于贵州省榕江县水尾乡。将草珊瑚茎和叶片分离，然后烘干至恒重，粉碎成粉样，过3号筛，备用。

主要试验仪器有101-3AB型电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）、FW-100型粉样机（北京市永光明医疗仪器有限公司）、CP224S型电子分析天平（德国赛多利斯公司）、RE-52AA型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）、Multiskan GO型酶标仪（美国Thermo Scientific公司）。

主要试剂有1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2′-联胺-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）、2，4，6-三吡啶基三嗪 （TPTZ）（美国 Sigma 公司）；乙醇、乙酸乙酯、VC等均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 不同提取物样品制备。分别称取草珊瑚茎、叶片干燥粉末样品50 g于1 L圆底烧瓶中，按照料液比1∶10分别加入45%乙醇、75%乙醇、95%乙醇、乙酸乙酯和水进行回流提取2 h，重复提取3次。待冷却至室温后过滤，合并滤液并浓缩，分别用圆底烧瓶旋转蒸发至干，4℃保存备用。测定时，用各提取溶剂复溶配制成不同浓度的溶液。

1.2.2 抗氧化活性测定。①DPPH自由基清除。参照文献[9]方法，用无水乙醇配制成0.1 mg/mL DPPH溶液，现配现用。分别吸取100 μL不同质量浓度的样品溶液和100 μL DPPH溶液于96孔酶标板中，37℃条件下避光孵育30 min，每个质量浓度设3个复孔，平行操作3次，在517 nm处用酶标仪测定吸光度，平均值记作A；以 75%乙醇 100 μL和 100 μL DPPH溶液混匀后在517 nm处测定的吸光度作对照，记作A0；空白为各样品溶液100 μL和75%乙醇 100 μL均匀混合后在517 nm处测定的吸光度，记作B。DPPH自由基清除率（%）=[1-（A-B）/A0]×100。 将不同浓度的VC溶液作为阳性对照，下同。②ABTS自由基清除。参照文献[10]配制ABTS工作液。参考文献[11]进行ABTS的清除活性测定。分别吸取40 μL样品溶液和160 μL ABTS工作液于96孔酶标板中，混匀后在37℃下孵育6 min，每个质量浓度设3个复孔，平行操作3次，于734 nm处用酶标仪测定其吸光度，取平均值记作A1。空白处理以75%乙醇代替供试样品溶液加入ABTS工作液，测得吸光度，记作A0。ABTS自由基清除率（%）=（A0-A1）/A0×100。③FRAP 铁离子还原能力。参照文献[12]配制FRAP工作液，现配现用，避光保存。参照文献[13]绘制FeSO4标准曲线。铁离子还原能力测定：分别吸取30 μL不同质量浓度的草珊瑚提取物溶液和180 μL FRAP工作液于96孔酶标板中，摇匀后37℃反应30 min，每个质量浓度设3个复孔，平行操作3次，用酶标仪在593 nm测定其吸光度。将75%乙醇代替供试样品溶液加入FRAP工作液。根据标准曲线，得到相应FeSO4当量（μmol/L）为 FRAP 值。

1.3 数据处理

利用SPSS 20.0统计分析软件对数据进行方差分析和显著性检验，用Excel 2007进行图表制作。

2 结果与分析

2.1 DPPH自由基清除活性

由图1可知，草珊瑚茎和叶的不同提取物与VC溶液的DPPH自由基清除活性存在较大差异。在一定浓度范围内，草珊瑚不同提取物对DPPH自由基清除率呈现出随提取物浓度升高而升高的趋势，且存在一定的线性关系（表1、2）。经计算，草珊瑚茎45%乙醇提取物、75%乙醇提取物、95%乙醇提取物、乙酸乙酯提取物和水提取物的IC50分别为0.288、0.113、0.116、0.474、1.900 mg/mL，草珊瑚叶 45%乙醇提取物、75%乙醇提取物、95%乙醇提取物、乙酸乙酯提取物和水提取物的IC50分别为0.141、0.263、0.248、0.453、0.741 mg/mL，不同提取物IC50差异均显著。VC溶液的DPPH自由基清除率的IC50为0.021 mg/mL。由于IC50值越小，各提取物对DPPH自由基清除率越高。因此，在各提取物中，草珊瑚茎提取物对DPPH自由基清除率表现为75%乙醇提取物＞95%乙醇提取物＞45%乙醇提取物＞乙酸乙酯提取物＞水提取物；草珊瑚叶提取物对DPPH自由基清除率表现为45%乙醇提取物＞95%乙醇提取物＞75%乙醇提取物＞乙酸乙酯提取物＞水提取物。草珊瑚不同组织的提取物中，茎以75%乙醇提取物对DPPH自由基清除率最高，活性最强，其次是95%乙醇提取物；叶以45%乙醇提取物对DPPH自由基清除率最高，活性最强，其次是95%乙醇提取物。

表1 草珊瑚茎不同提取物DPPH自由基清除率的IC50

表2 草珊瑚叶不同提取物DPPH自由基清除率的IC50

2.2 ABTS自由基清除活性

如图2所示，草珊瑚不同提取物均表现出良好的ABTS自由基清除活性，在一定浓度范围内有明显的量-效关系（表3、4）。草珊瑚茎45%乙醇提取物、75%乙醇提取物、95%乙醇提取物、乙酸乙酯提取物和水提取物的 IC50分别为 0.281、0.235、0.254、0.530、0.219 mg/mL，草珊瑚叶45%乙醇提取物、75%乙醇提取物、95%乙醇提取物、乙酸乙酯提取物和水提取物的 IC50分别为 0.283、0.200、0.057、0.184、0.124 mg/mL，VC溶液ABTS自由基清除率的IC50为0.035 mg/mL。可见，在ABTS抗氧化评价体系中，草珊瑚茎提取物活性顺序是水提取物＞75%乙醇提取物＞95%乙醇提取物＞45%乙醇提取物＞乙酸乙酯提取物；草珊瑚叶提取物活性顺序是95%乙醇提取物＞水提取物＞乙酸乙酯提取物＞75%乙醇提取物＞45%乙醇提取物。

表3 草珊瑚茎不同提取物ABTS自由基清除率的IC50

表4 草珊瑚叶不同提取物ABTS自由基清除率的IC50

2.3 FRAP铁离子还原能力

从图3可以看出，各提取物的Fe3+还原能力均低于同浓度的阳性对照。在一定质量浓度范围内，各提取物Fe3+还原能力随各提取物浓度的升高而增大，且呈现一定线性关系，所有线性回归方程R2值均＞0.9，表明方程的拟合度很高（表5、6）。通过计算各回归方程斜率k，其中草珊瑚茎45%乙醇提取物、75%乙醇提取物、95%乙醇提取物、乙酸乙酯提取物和水提取物的斜率 k分别为 195.53、459.26、209.76、150.30、195.95 mg/mL，草珊瑚叶45%乙醇提取物、75%乙醇提取物、95%乙醇提取物、乙酸乙酯提取物和水提取物的斜率k分别为204.13、134.23、207.81、125.30、388.76 mg/mL，VC溶液对照品的还原线性方程斜率k为1 633.70。朱萱萱等[14]研究结果表明，k值越大，铁离子还原能力越强，即抗氧化活性越强。因此，通过k值可以判断，草珊瑚茎提取物活性顺序是75%乙醇提取物＞95%乙醇提取物＞水提取物＞45%乙醇提取物＞乙酸乙酯提取物；草珊瑚叶提取物活性顺序是水提取物＞95%乙醇提取物＞45%乙醇提取物＞75%乙醇提取物＞乙酸乙酯提取物。

表5 草珊瑚茎不同提取物铁离子还原能力

表6 草珊瑚叶不同提取物铁离子还原能力

2.4 草珊瑚不同提取物抗氧化活性综合评价

不同抗氧化活性评价方法的反应原理和条件存在差异，所以使用不同方法测定得到的抗氧化活性结果并不完全一致。参照马艳芝[15]研究方法，使用隶属函数法对草珊瑚不同提取物的抗氧化活性进行综合比较。从表7、8可以看出，草珊瑚茎不同提取物中，抗氧化隶属函数均值以75%乙醇提取物最高，为0.977，抗氧化活性最强，乙酸乙酯提取物隶属函数均值最低，为0.326，抗氧化活性最弱；草珊瑚叶不同提取物中，抗氧化隶属函数均值以95%乙醇提取物最高（0.701），抗氧化活性最强，乙酸乙酯提取物隶属函数均值为最低（0.314），抗氧化活性最弱。

表7 草珊瑚茎不同提取物抗氧化活性综合评价值

表8 草珊瑚叶不同提取物抗氧化活性综合评价值

3 讨论

因呼吸、环境污染、射线等因素，人体内必定不断产生自由基，大量的氧自由基会引起氧化损伤。现代医学研究证明，生物体衰老、免疫性疾病，甚至癌变等都与自由基过量产生有关。抗氧化主要是指抗氧化自由基[16]。天然抗氧化剂由于自身的优势，已成为当前研究热点。已有研究表明，秋葵[17]、石斛[18]、桔梗[19]等许多天然植物材料均具有较强的抗氧化活性。

黄明菊等[8]研究发现，不同产地草珊瑚药材均有较好的抗氧化活性，在研究中通过不同溶剂提取草珊瑚不同组织，并采用DPPH和ABTS自由基清除活性测定、铁离子还原能力测定等3种方式对草珊瑚不同提取物进行抗氧化活性比较，均显示草珊瑚不同提取物具有抗氧化活性，该结果也证实草珊瑚具有抗氧化活性。在各抗氧化评价方法中，DPPH自由基清除率测定结果显示，草珊瑚茎75%乙醇提取物活性最强，叶45%乙醇提取物活性最强；ABTS自由基清除率测定结果显示，草珊瑚茎水提取物活性最强，叶95%乙醇提取物活性最强；FRAP法测定结果显示，草珊瑚茎75%乙醇提取物活性最强，叶水提取物活性最强。可以发现，在对草珊瑚不同提取物进行抗氧化活性评价中，因采用评价方式不同，最终得到的抗氧化活性结果并不完全一致。马艳芝[15]用不同测定方法测定同种柴胡抗氧化活性时，最终也表现出不同测定方法间柴胡的抗氧化能力存在一定差异。

为综合比较草珊瑚不同提取物抗氧化活性，在研究中采用了隶属函数法进行综合评价，结果显示草珊瑚不同组织提取物均以乙酸乙酯提取物抗氧化活性最弱。然而，在天然植物或微生物提取物抗氧化研究中，常发现乙酸乙酯提取物抗氧化活性较高，如朱萱萱等[14]发现金樱根部位提取物的乙酸乙酯抗氧化活性最强，苏天骄等[20]在瓦布贝母内生真菌发酵产物抗氧化活性研究中，发现乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物的抗氧化活性较强。研究结果均发现乙酸乙酯提取物抗氧化活性弱，推测可能在采用乙酸乙酯对草珊瑚进行提取时，主要提取得到挥发油类成分，而试验过程中旋干浓缩步骤造成大量具有抗氧化活性的挥发油类成分挥发掉。黄酮类化合物是草珊瑚中最主要的活性成分之一。徐 耀等[21]采用75%乙醇提取草珊瑚并经纯化得到黄酮类提取物，且研究发现该类物质具有较强的抗氧化活性，采用DPPH自由基清除法测定，20 μg/mL草珊瑚黄酮提取物清除率达到39.2%，并强于VC。郁建生等[22]采用沸水提取及乙醇浸提2种工艺开展草珊瑚总黄酮提取研究发现，乙醇提取法草珊瑚总黄酮得率高，是沸水提取法的3.25倍[22]。在研究中同样也用到了乙醇溶液和水对草珊瑚进行提取，在抗氧化活性综合表现方面，草珊瑚茎75%乙醇提取物抗氧化活性最强，叶95%乙醇提取物抗氧化活性最强，均高于草珊瑚水提取物，该结果也间接证明采用乙醇溶液进行草珊瑚提取有利于提取黄酮类成分并增强提取物的抗氧化活性。此外，茎和叶提取物的抗氧化活性存在差异，推测应该与不同组织间有效成分含量存在差异有关。

4 结论

本研究采用45%乙醇溶液、75%乙醇溶液、95%乙醇溶液、乙酸乙酯及水等溶剂分别对草珊瑚茎和叶进行提取，并对各提取物进行抗氧化活性评价。结果表明，草珊瑚不同提取物均有一定的抗氧化活性，且在一定浓度范围内具有明显的量—效关系。DPPH自由基清除率测定结果显示，草珊瑚茎75%乙醇提取物活性最强，叶45%乙醇提取物活性最强；ABTS自由基清除率测定结果显示，草珊瑚茎水提取物活性最强，叶95%乙醇提取物活性最强；FRAP法测定结果显示，草珊瑚茎75%乙醇提取物活性最强，叶水提取物活性最强。隶属函数法综合评价结果表明，草珊瑚茎75%乙醇提取物抗氧化活性最强，草珊瑚叶95%乙醇提取物抗氧化活性最强，可作为天然抗氧化剂进行开发。在下一步研究中可针对乙醇溶液提取草珊瑚结合抗氧化活性测定进行优化，研究草珊瑚抗氧化药效物质基础。