UPLC法测定消炎止痛膏巴布膏剂中咖啡酸的含量

李 祥，安雅婷，周 淼

（天津市中医药研究院附属医院，天津 300120）

消炎止痛膏（津药制字Z20070286号）是天津市中医药研究院附属医院院内制剂，其处方组成包括木瓜、大黄、醋乳香、醋没药、蒲公英等7味中药。消炎止痛膏为外用软膏剂，涂敷于跌打损伤及疮疡肿毒处，可发挥活血散瘀、清热消肿止痛的功效［1-2］。蒲公英被誉为“天然抗生素”，有广谱杀菌和抑菌作用，与酚酸类物质有一定关系［3］。咖啡酸是蒲公英的主要成分之一，是一种酚酸类化合物，为黄色晶体，微溶于冷水，易溶于热水及冷乙醇，能吸收紫外线。咖啡酸有较广泛的抑菌和抗病毒活性，也是消炎止痛膏发挥药效的主要活性成分。消炎止痛膏虽然临床上已取得较好的治疗效果，但该剂型使用不方便。消炎止痛膏巴布膏剂将消炎止痛膏原剂型的缺点进行改进，不仅能使药物有效成分透皮快速吸收，提高生物利用度，增强疗效，而且携带方便，更有利于患者的使用，可提高用药依从性。为使消炎止痛膏在临床上发挥更好疗效，延长释药时间，控制药物进入体内的速率，维持平稳的血药浓度，减少皮肤的刺激，根据中医药特色理论，结合现代制剂手段，可将传统中药膏剂消炎止痛膏制备成巴布膏剂。本文对消炎止痛膏巴布膏剂中咖啡酸含量测定方法进行研究。

1 仪器与试剂

1.1 设备仪器ACQUITY UPLCTM I-Class System超高效相色谱仪（美国Waters公司），HWS-150B恒温恒湿培养箱（中国北京市永光明医疗仪器有限公司），Smart2Pure超纯水仪（美国赛默飞公司），WGLL-125BE鼓风干燥箱（中国天津泰斯特公司），Sorvall Legend Micro 21微量离心机（美国赛默飞公司），AS62.R2十万分之一天平（波兰RADWAG公司），涡旋仪（中国江苏天翎仪器有限公司）。

1.2 药品与试剂 大黄（批号121200401，产地：青海，购于北京宏济药业有限公司），蒲公英（批号21051511，产地：甘肃省天水市，购于安徽协和成药业饮片有限公司），木瓜（批号388210401，产地：安徽，购于北京宏济药业有限公司），栀子［4］（批号585210401，产地：浙江，购于北京宏济药业有限公司），土鳖虫（批号2101012-01，产地：江苏，购于天津中药饮片厂有限公司），乳香（批号201203207，产地：埃塞俄比亚，购于天津市中药饮片厂有限公司），没药（批号2012068-03，产地：索马里，购于天津市中药饮片厂有限公司），上述药材经天津市中医药研究院附属医院孙浩主任中药师鉴定、药检室检测均符合《中国药典》2020年版［5］及《天津市中药炮制规范》2018版［5］的要求；咖啡酸对照品（批号110885-201703，中国食品药品检定研究院）；酒石酸（批号150722）、甘羟铝（批号150514）、EDTA（批号150616）均为药用（上海森磊化工有限公司）；二氯甲烷、盐酸、甲醇、甲酸等均为分析纯，乙腈为色谱纯（天津康科德科技有限公司），水为超纯水（自制）。消炎止痛膏巴布膏剂样品为本院制剂室提供（批号001、002、003）。

2 处方组成及制法

2.1 处方组成 本制剂由大黄、土鳖虫、蒲公英、栀子、木瓜、醋乳香、醋没药7味饮片提取液及酒石酸、甘油、AP-800、甘羟铝、EDTA等组成。

2.2 制法 上述7味饮片1 647 g，加适量水浸泡，分别加8倍量的水，煎煮3次，每次煎煮2 h，合并煎液，过滤，浓缩至规定相对密度，冷却。加入酒石酸等5种辅料约310 g至溶，搅拌至糊状，制成1 000 g膏体。倾至背衬上，并覆盖上压花膜，滚压至约1.5~2 mm厚，固化，剪切成每块为5 cm×10 cm的成品。每贴含膏量为20 g。

3 含量测定方法研究

3.1 溶液的制备

3.1.1 供试品溶液制备 取样品1片，除去盖衬，置于锥形瓶中，加入25 ml 8%盐酸，超声10 min，二氯甲烷萃取3次，每次25 ml，合并二氯甲烷层，水浴蒸干，甲醇溶解残渣并转移至50 ml量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，离心，用0.22 μm微孔滤膜过滤，续滤液备用。

3.1.2 对照品溶液制备 精密量取咖啡酸对照品，加甲醇定容至5 ml量瓶中，制得对照品溶液浓度为1.02 mg/ml。

3.1.3 阴性样品溶液制备 取不含蒲公英的巴布膏剂，按“3.1.1”项下方法制备。

3.2 色谱条件ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色谱柱；柱温：45℃；样品室温度：4℃；进样体积：2 μl；流动相：0.1%甲酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脱，洗脱程序如表1所示；流速：0.3 ml/min；检测波长：320 nm。

表1 梯度洗脱程序

3.3 系统适用性试验 精密量取对照品、供试品和阴性样品溶液各2 μl，按“3.2”项下色谱条件进行测定，对照品的理论塔板数不低于5 000。在此色谱条件下，咖啡酸色谱峰与相邻色谱峰之间的分离度大于1.5，对称因子在0.95~1.05之间，咖啡酸与其他成分可以有效地进行分离，阴性样品对测定无干扰。色谱图见图1。

图1 对照品（A）供试品（B）阴性样品（C）UPLC色谱图

3.4 线性试验 精密量取“3.1.2”项下对照品溶液，将其稀释为不同浓度梯度的标准溶液。吸取各2 μl注入色谱柱，按“3.2”项下色谱条件进行测定，以浓度为X轴，峰面积为Y轴绘制标准曲线。线性回归方程为Y=36 652.543 1 X-5 463.025 4（r=0.999 9）。在0~70 μg/ml浓度范围内线性关系良好。

3.5 精密度试验 精密吸取“3.1.2”项下对照品溶液，按“3.2”项下色谱条件重复进样6次，每次1 μl，峰面积RSD值为0.2%，表明精密度良好。

3.6 重复性试验 精密吸取同一批样品（批号003），制备供试品溶液，平行6份，处理后分别进样5 μl测定，RSD值为1.02%，表明该方法重复性良好。

3.7 稳定性试验 将供试品溶液及对照品溶液分别于室温下放置0、6、12、18和24 h时进行检测，记录峰面积。结果显示供试品溶液中咖啡酸色谱峰面积的RSD为1.24%，对照品溶液中咖啡酸色谱峰面积的RSD为1.1%，表明供试品溶液及对照品溶液于室温下放置24 h内稳定性良好。

3.8 加样回收率试验 精密吸取已知含量的样品（批号003）共6份，精密加入对照品溶液（156.4 μg/ml）1 ml，制备供试品溶液，在上述色谱条件下进行测定，平均回收率为88.04%，RSD值为2.95%，见表2。

表2 加样回收率试验结果

3.9 含量测定 取3批样品各1贴按“3.1.1”项下方法制备供试品溶液，按“3.2”项下色谱条件分别进样分析，记录咖啡酸色谱峰面积，将峰面积代入标准曲线计算各批次样品含量，咖啡酸含量见表3。

表3 消炎止痛膏巴布膏剂含量

3.10 检测限度 根据前期研究及转移率的试验结果，按测定平均含量的80%计算，每贴含咖啡酸不得少于0.62 mg。

4 讨论

4.1 测定方法 本文对消炎止痛膏巴布膏剂中咖啡酸含量测定方法进行研究。UPLC方法与传统的高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）相比，具有高分离度、高速度以及高灵敏度的优势，其色谱柱填料粒径更小（1.7 μm）、检测器采样速度更快。在本试验中，使用UPLC可提高分离度、改善峰形，且能够提高样品分析效率。

4.2 色谱条件筛选 本研究采用UPLC方法建立咖啡酸含量测定方法，经过优化不同色谱柱型号（BEH C18、BEH shield RP18、CSH C18）、不同流动相体系（甲醇-水、乙腈-水）、不同柱温（30、35和40℃）、不同流速（0.3和0.4 ml/min）等色谱条件，结果显示前文所述条件为最佳色谱条件，可以满足咖啡酸含量测定的分离检测要求。

4.3 样品提取 巴布贴剂中由于基质具有一定的黏性，对样品的提取方法具有一定要求，经文献调研发现，目前采用的提取方法有以甲醇等有机试剂进行加热回流提取或超声提取。咖啡酸是一种有机酸，属于酚酸类化合物，有较广泛的抑菌和抗病毒活性，微溶于冷水，易溶于热水及冷乙醇。本项目综合考虑咖啡酸理化性质，最终采用的是甲醇超声方法提取巴布膏剂中指标成分，加样回收率结果显示该方法满足相关要求。

4.4 回收率试验 研究结果显示平均回收率为88.04%，按照《中国药典》2020年版［6］四部分析方法指导原则中数据要求规定，样品中待测定成分含量和回收率限度关系，在基质复杂组分含量低于0.01%及多成分等分析中，可适当放宽回收率限度。基质处方中AP-800、甘羟铝、EDTA、甘油对处方的影响较大。AP-800是构成巴布膏剂亲水性凝胶骨架形体的基本物质，是一种优质的巴布膏剂骨架材料，其聚丙烯酸和聚丙烯酸钠的比例相等，黏度、分子链长度、交联程度和pH等适中。研究表明，甘羟铝中的Al3+与AP-800中的羧基交联形成交联型基质，交联速度适中，有利于巴布膏剂的制备和涂布。甘油为保湿剂。螯合剂EDTA可控制交联反应程度，增强巴布膏剂的保湿性及黏附性。因为提取物中化学成分复杂，含有倍半萜内酯、糖类、三萜类、有机酸、生物碱类、黄酮等，其复杂的化学成分与空白基质中的Al3+、羧基、螯合剂EDTA等产生反应，导致膏体黏性变大，内聚力减小。本制剂为中药制剂，组分多且基质成分具有吸附性及不易洗脱等因素，同时实际样品测定中每克膏体中含咖啡酸约38 μg/g，因此按照《中国药典》规定要求回收率可在80%~115%之间。