熔解曲线法在痰涂阴肺结核患者中的应用

梁立锋

广东省云浮市慢性病防治中心检验科，广东云浮 527300

结核病是由结核分枝杆菌复合群(MTB)引起的一种严重危害人类健康的呼吸道传染病，尤其以肺结核多见，严重影响人类的生命安全。实验室检测是确诊肺结核的重要依据，根据结核病防治要求，现行采用痰涂片找抗酸杆菌、痰培养等方法检测，但其不能满足快速诊治的临床要求，亟须寻找一种快速且经济的病原学检测方法，为临床快速诊断提供依据。本研究采用实时荧光定量PCR、熔解曲线法检测痰涂阴患者中的结核分枝杆菌核酸和利福平耐药突变基因，与痰培养及表型药敏试验进行比对，探讨其应用价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2020年1月至2021年9月于本院结核门诊就诊的1 040例患者的痰标本，患者经直接数字化X线摄影系统检查有异常，临床有咳嗽、咳痰两周以上等症状，且全部为痰涂阴肺结核可疑者，年龄17～82岁，平均(45±17)岁。

1.2仪器与试剂 金胺O染色液、罗氏固体培养基、罗氏含药培养基采用珠海贝索生物技术有限公司产品；核酸提取仪、结核分枝杆菌核酸提取试剂、MTB基因和利福平耐药突变检测试剂采用厦门致善生物科技股份有限公司产品，扩增分析仪由上海宏石医疗科技有限公司提供。

1.3方法

1.3.1染色镜检 采用金胺O染色法，操作及结果报告按《痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》[1]执行。

1.3.2痰培养 采用中性离心法，操作及结果报告按《分枝杆菌分离培养标准化操作程序及质量保证手册》[2]执行。

1.3.3药敏试验 采用比例法，操作及结果报告按《结核分枝杆菌药物敏感性试验操作程序及质量保证手册》[3]执行。

1.3.4DNA提取 取1.5 mL经4%氢氧化钠液化后的痰标本，以13 000×g离心5 min，去掉上清液，加入500 μL结核的DNA提取液，涡旋振荡混匀。99 ℃加热10 min，取出冷却至室温，把所有标本加至提取条中并加20 μL增强液放入提取仪提取，提取液作DNA模板。

1.3.5MTB核酸检测、利福平耐药突变检测 采用实时荧光定量PCR法检测MTB核酸：把15 μL DNA模板和15 μL裂解液加入检测体系，振荡5 s，瞬时离心，去除大的气泡，转到PCR扩增仪扩增。利福平耐药突变检测：采用熔解曲线法检测。每个标本使用A和B两个反应体系，每个体系采用FAM和TET两个通道，共4个通道检测，通过比较标本与阳性对照之间熔解曲线熔点(TM值)的差异判断样品是否发生突变。A、B反应体系的配制为：取n×19.6 μL Mix A或Mix B和n×0.4 μL TB酶混合液加入1.5 mL离心管内，振荡5 s，分别向PCR反应管内分装20 μL即为反应体系。向反应体系再加入5 μL相应提取样品或阳/阴对照，振荡5 s，瞬时离心，去除大的气泡，转到PCR扩增仪进行扩增和熔解曲线分析，以4个通道任一通道中样品的熔点低于阳性对照2 ℃时判定为突变型，样品对利福平耐药。操作及结果判读严格按照试剂说明书进行。

1.3.6质量控制 (1)人员培训：操作人员全部经省级结核病防治机构培训和省临床检验中心核酸扩增培训，具有省级认可的结核病实验室操作能力和PCR上岗证。(2)罗氏固体培养基、含药罗氏培养基，每批次均有厂家提供的敏感性测试和无菌试验合格报告。(3)每年均通过国家和省级组织的PCR质评及药敏质评考核。

1.4统计学处理 使用SPSS21.0统计软件进行数据分析，计数资料以例数或百分率表示，一致性检验采用Kappa检验。

2 结 果

2．1MTB核酸检测和痰培养结果 把金胺O染色镜检结果为阴性的1 040份痰标本分别进行痰培养和实时荧光定量PCR检测，痰培养检测为MTB的有74份，阳性率为7.1%；实时荧光定量PCR检测为MTB的有101份，阳性率为9.7%，两者经一致性检验，有较高的一致性(Kappa=0.83)。见表1。

表1 实时荧光定量PCR检测与痰培养结果(n)

2．2利福平耐药突变和表型药敏结果 实时荧光定量PCR检测为阳性的101份痰标本中，剔除Ct值>20和实时荧光定量PCR检测为阳性而痰培养检测为阴性的标本，最终有74例患者的标本纳入研究，利福平耐药突变检测全部有效。熔解曲线法检测利福平耐药7例，rpoB基因513～520区域共8个氨基酸密码子，突变4例，rpoB基因529～533区域共5个氨基酸密码子，突变3例，耐药率为9.5%；表型药敏试验检测利福平耐药8例，耐药率为10.8%；两者经一致性检验，有较高的一致性(Kappa=0.79)。见表2。

表2 熔解曲线法与表型药敏试验结果(n)

3 讨 论

目前使用的结核分枝杆菌检测方法包括痰涂片染色镜检、痰培养和分子生物学检查。痰涂片染色找到抗酸杆菌和痰培养阳性被认为是肺结核诊断的“金标准”。痰涂片染色找到抗酸杆菌可快速诊断，但其受痰标本质量、观察视野等诸多因素影响，其敏感性较低；而痰培养耗时较长[4]，易造成延迟诊断，不能快速切断传染源。有研究表明实时荧光定量PCR技术可用于结核的快速诊断和利福平耐药性检测[5]，但试剂成本高、仪器维护费用高。熔解曲线法是PCR和熔解曲线分析方法的结合，由于野生型序列具有自身特定的熔点，当基因突变时探针结合力下降导致熔点下降，通过监测荧光杂交信号区分出野生型与突变型。本研究将痰涂阴疑似肺结核患者的标本采用实时荧光定量PCR、熔解曲线法检测痰标本中的结核分枝杆菌核酸基因、利福平耐药突变，与痰培养、表型药敏试验结果比较，一致性较高(K>0.75)。

本研究痰培养检测出阳性74例，阳性率为7.1%，实时荧光定量PCR检测出阳性101例，阳性率为9.7%，实时荧光定量PCR阳性率比痰培养阳性率略高，与核酸检测的敏感性高有关，比刘兰瑞等[5]报道的低，原因可能与本研究纳入对象为痰涂阴患者有关。表型药敏试验检测利福平耐药8例，熔解曲线法检测利福平耐药7例，氨基酸密码子区域集中在513～520区域和529～533区域，其中的差异值得进一步探索，但熔解曲线法与曾松芳等[6]、陈榕等[7]报道的结果一致，说明此方法具有可接受的一致性和很好的替代性。

熔解曲线法是国内产品，检测时间在3 h左右，比类似的国外产品检测时间略长[8]，利福平检测覆盖rpoB基因507～533共27个氨基酸密码子，但国内试剂成本低、仪器维护费用少、可扩展的药物种类比国外的丰富[9]，还能选择性地检测利福平、异烟肼、卡那霉素、喹诺酮类药物的突变基因，使熔解曲线法具有选择优势。有报道对利福平耐药的患者80%是耐多药患者，这样一般只需检测利福平的耐药性，就可大致推断患者的耐多药性，可大幅降低患者的负担、提高患者的依从性和化疗的准确性[10]。同时，实时荧光定量PCR结核分枝杆菌核酸检测试剂使用非常方便，试剂已制成干粉并在八联管中保存，检测时只需加DNA模板和裂解液就可上PCR扩增仪扩增；而耐药突变检测覆盖了利福平、异烟肼、卡那霉素、喹诺酮类药物，更能符合临床诊断耐多药、多耐药和广泛耐药结核病的需求。

综上所述，实时荧光定量PCR、熔解曲线法与痰培养、表型药敏试验检测具有较好的一致性(Kappa>0.75)，熔解曲线法试剂成本低、仪器维护费用低，检测耐药突变的药物品种全面，生物安全性能好，且快速经济，使用方便，可以用于痰标本直接检测；因此该方法在快速诊断肺结核和耐药结核病上具有应用前景，对结核病防控具有重要意义。有条件的结核病防治机构可以同时采用痰涂片染色镜检和痰培养检测，对痰阴性患者再作核酸检测，对核酸阳性再行药物耐药突变检测，这样可及早发现肺结核和耐药肺结核患者。但此方法也有其不足之处：(1)有些标本会出现核酸抑制；(2)Ct值>20(浓度低)时测耐药突变出现不明确的结果；(3)耐药突变试剂配制麻烦；(4)利福平检测只覆盖rpoB基因507～533区域共27个氨基酸密码子。