探讨MiR-181a、TGFβR2对食管癌细胞ECA109的影响*

李雨蔚，徐润，侯维，蹇顺海，陈筱莉，何欣蓉

1.川北医学院附属医院病理科，四川南充 637000；2.川北医学院病理教研室，四川南充 637000；3.成都市第二人民医院，四川成都 610011

食管癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，我国90%的病例为食管鳞状细胞癌，由于食管癌起病隐匿，80%以上患者确诊时已进入中晚期，因此食管癌患者总体生存时间较短，5年生存率低，严重影响人类的健康。TGF-β/Smad信号通路参与许多病理过程，在肿瘤中发挥着特别广泛的作用［1-2］。因此调节TGF-β途径对食管癌患者具有重要意义，TGF-β有三种亚型（TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3）和三种相应的TGF-β受体（TGF-βR1、TGF-βR2和TGF-βR3）。前两种受体具有激酶活性，磷酸化并激活TGF-β/Smads途径下游，而TGF-βR3没有激酶活性。在TGF-β信号转导中，TGF-β依次与TGF-βR2和TGF-βR1结合，形成异基因复合物。因此，TGFβR2与TGF-β结合，发挥关键作用，启动信号转导，在多种肿瘤中发现TGFβR2信号异常，影响肿瘤的生物学特性和患者的生存。微小RNA(miRNA)是TGFβR2功能最重要的调节因子之一［3］。miR-181家族，包括miR-181a、miR-181b、miR-181c和miR-181d，是最早在造血细胞中特异表达的miRNA之一。人类miR-181a和miR-181b基因聚集在一起，位于1号染色体(miR-181a-1和miR-181b-1)和9号染色体(miR-181a-2和miR-181b-2)上，研究发现miR-181a在口腔鳞状细胞癌、高级别软骨肉瘤、乳腺癌、胃癌、食管癌等癌中表达均异常［3-8］。利用生物信息学数据库miRBase预测miR-181a的靶基因，其中包括TGFβR2，并且已有学者在胃癌中采用双荧光素酶报告实验检测发现，TGFβR2为miR-181a的靶基因，但在食管癌中miR-181a与TGFβR2的机制目前尚不清楚，本研究将检测与分析miR-181a、TGFβR2在食管鳞状细胞癌ECA109中的表达及其对细胞增殖的影响，并初步探讨可能的机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

DMEM/HIGH GLUCOSE培养基购自美国HyClone公司。新生牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司。青霉素—链霉素溶液购自武汉博士德生物工程有限公司。0.25%胰酶购自美国Gibco。增强型CCK-8试剂盒购自江苏碧云天生物技有限公司、组织/细胞RNA快速提取试剂盒购自艾德莱生物。All-in-OneTM miRNA qRT-PCR DetectionKit购自GeneCopoeia。mRNA逆转录试剂盒购自Thermo Scientific。Bestar SybrGreen qPCR mastermix购自DBI Bioscieno； RT-PCR引物、 miR-181a mimics、 mimics NC、miR-181a inhibitor、inhibitor NC由生工生物工程（上海）股份有限公司设计。二氧化碳培养箱（美国Thermo Forma Scientific公司）、全波长酶标仪（Thermo）、荧光定量PCR仪（德国Bio.Rad公司）、倒置显微镜（德国Leica）。

1.2 细胞来源和培养

人正常食管上皮细胞株HEEC和人食管鳞癌细胞株ECA-109来源于川北医学院分子生物学研究所。HEEC、ECA109均为贴壁细胞，培养于含体积分数10%新生牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的DMEM/HIGH GLUCOSE完全培养基中，在37℃、5%CO2培养箱中培养。

1.3 细胞转染和分组

按5×105个/孔的细胞密度将ECA109接种于六孔板中培养过夜，待细胞密度达40%～50%，按照Lipo6000TM试剂说明书进行转染。分为五组：blank control组、miR-181a mimics转染组、 mimic NC阴性对照组、miR-181a inhibitor转染组、inhibitor NC阴性对照组。转染6 h后用新鲜的完全培养基替换原培养基继续培养48 h。

1.4 CCK8法检测

按每孔8×103个细胞接种于96孔板，每个样本重复5个复孔，于0、12 h、24 h、48 h各时间点每孔加入10μL的增强型CCK-8试剂，用加了完全培养基和10μL的增强型CCK-8试剂但没有加入细胞的孔作为空白对照，继续培养2 h后，在450 nm波长处用酶标仪测定吸光度值。

1.5 qRT-PCR

总RNA的提取使用组织/细胞RNA快速提取试剂盒提取空白对照组及转染后ECA109中的总RNA，检测RNA的纯度及浓度后于-80℃保存（OD260/OD280比值在2.0～2.2之间）。逆转录及qRT-PCR检测miR-181a、TGFβR2mRNA、Smad2mRNA的表达量使用All-in-OneTM miRNA qRT-PCR Detection Kit试剂盒、Thermo Scientific的mRNA逆转录试剂盒将细胞中提取的RNA逆转录成cDNA，反应条件分别为为37℃60 min、85℃5 min，65℃5 min、25℃5 min、42℃60 min、70℃5 min。将得到的cDNA稀释后，按照All-in-OneTM miRNA qRT-PCR Detection Kit试剂盒、Bestar SybrGreen qPCR mastermix说明书分别进行荧光定量PCR，反应条件分别为95℃10 min，1个循环；95℃10sec、60℃20sec、72℃10sec，40个循环和95℃2 min，1个循环；95℃10sec、55℃30sec、72℃30sec，40个循环，以U6和GAPDH作为内参，miR-181a、TGFβR2mRNA表达量用表示。miR-181a正向引物序列5'-GCGGTAACATTCAACGCTGTCG-3'，反向引物序列5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'；TGFβR2正向引物序列 5'-GTGGCTGTATGGAGAAAGAATG-3'，反向引物序列5'-CAAGTCAGGATTGCTGGTGTT-3'；U6正向引物序列5'-CGCTTCGGCAGCACATATA-3'，反向引物序列5'-TTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'；GAPDH 正向引物序列 5'-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3'，反向引物序列5'-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3'。

1.6 Western Blot

分别收集转染4 d后的各组细胞于离心管中，PMSF裂解提取蛋白，采用Bradford蛋白定量试剂盒测蛋白的浓度，每孔取12μL蛋白质行SDS-PAGE电泳（80 min 100 V），转膜（80 min 0.2 A），5%脱脂牛奶封闭3 h，加入RabbitAnti-TGFβR2（1：300稀释），4℃过夜后加入二抗羊抗兔IgG（1：5 000稀释），室温孵育1 h，采用特超敏ECL化学发光试剂盒显影，以GAPDH作为内参，采用Image J软件分析目的蛋白和内参的光密度值，以目的蛋白和内参的光密度值的比值表示目的蛋白的相对表达水平。

1.7 统计学方法

采用SPSS 23.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验。计数资料以例数和百分比（%）表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CCK8法检测

采用CCK8法检测ECA109细胞中各组在0 h、12 h、24 h、48 h的增殖情况。如表1展示了各组在0 h、12 h、24 h、48 h时的吸光度值，以s表示。图1显示，miR-181a mimics组与空白对照组、mimic NC组相比，在12 h、24 h、48 h吸光度值升高，差异有统计学意义（P＜0.05），空白对照组与mimic NC组之间无明显差异。miR-181a inhibitor组与空白对照组、inhibitor NC组相比，在12 h、24 h、48 h吸光度值降低，差异有统计学意义（P＜0.05），空白对照组与inhibitor NC组之间无明显差异。

图1 CCK8法检测ECA109五组细胞的增殖水平

表1 转染后ECA109五组细胞增殖能力的比较(±s)

表1 转染后ECA109五组细胞增殖能力的比较(±s)

组别0 h0.488 4±0.047 30.488 7±0.031 80.496 6±0.009 40.488 9±0.025 20.488 9±0.022 00.0560.994 12 h0.942 1±0.016 51.072 2±0.026 20.892 1±0.017 10.742 7±0.026 30.953 9±0.026 2108.5200 24 h1.198 5±0.068 91.483 2±0.051 21.121 9±0.055 10.962 5±0.026 51.214 4±0.023 061.3360 48 h1.635 3±0.058 12.124 3±0.050 51.604 6±0.021 51.384 5±0.048 41.621 9±0.088 689.2130 Blank control MiR-181a mimics Mimic NC MiR-181a Inhibitor Inhibitor NC F值P值

2.2 miR-181a在HEEC、ECA109细胞中的表达情况

如图2所示，qRT-PCR检测结果显示，人正常食管上皮细胞株HEEC，人食管鳞癌细胞株ECA109中miR-181a的表达水平分别为（1.005±0.124）、（3.454±0.197），食管鳞癌细胞株中miR-181a的表达量明显高于人正常食管上皮细胞株的表达量，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图2 miR-181a在HEEC、ECA109细胞株中的表达情况

2.3 miR-181a在各转染组中的表达情况

如图3a所示，qRT-PCR检测结果显示，ECA109细胞miR-181a mimics转染组miR-181a的表达水平（33.525 3±1.089 7）明显高于空白对照组（1.020 4±0.251 5）、mimic NC组（0.855 9±0.093 0），差异有统计学意义（P＜0.001）；图3b所示，qRT-PCR检测结果显示，ECA109细胞miR-181a inhibitor转染组miR-181a的表达水平（0.022 1±0.007 6）明显低于空白对照组（1.020 4±0.251 5）、inhibitor NC组（0.955 9±0.309 9），差异有统计学意义（P＜0.001）。

图3b qRT-PCR检测miR-181a inhibitor转染后miR-181a表达

图3a qRT-PCR检测miR-181a mimics转染后miR-181a表达

2.4 TGFβR2在各转染组中的表达情况

如图4a所示，qRT-PCR检测结果显示，ECA109细胞miR-181a mimics转染组TGFβR2mRNA的表达水平（0.466 5±0.037 7）明显低于空白对照组（1.000 8±0.049 2）、mimic NC组（1.052 9±0.098 2），差异有统计学意义（P＜0.001）。图4b所示，qRT-PCR检测结果显示，ECA109细胞miR-181a inhibitor转染组TGFβR2mRNA的表达水平（1.606 7±0.062 8）明显高于空白对照组（1.0080±0.049 2）、inhibitor NC组（1.120 7±0.104 8），差异有统计学意义（P＜0.001）。如图5、6所示，Western Blot结果显示miR-181a mimics转染组TGFβR2蛋白表达水平较阴性对照组明显下降，差异有统计学意义（P＜0.01）。miR-181a inhibitor转染组TGFβR2蛋白表达水平较阴性对照组升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图4b WB检测miR-181amimics转染后TGFβR2蛋白表达

图4a qRT-PCR检测miR-181ainhibitor转染后GFβR2mRNA表达

3 讨论

图5a WB检测miR-181amimics转染后TGFβR2蛋白表达

图5b WB检测miR-181a inhibitor转染后TGFβR2蛋白表达

图6a mimics转染组与NC组TGFβR2蛋白相对表达量

图6b inhibitor转染组与NC组TGFβR2蛋白相对表达量

食管癌是常见的消化道肿瘤之一，在我国癌症死亡原因中排名第四［9］。尽管有包括手术干预、化疗和同时放化疗在内的多模式治疗［10］，但治疗效果仍不佳。因此，为了提高晚期食管癌患者的生存率，迫切需要在早期诊断和治疗方面取得进展。在TGF-β信号转导途径中，最重要的受体是TGFβR2，它与TGF-β结合并激活TGF-β信号级联，miRNA是TGFβR2最重要的翻译后调节因子之一。在本研究中采用qRT-PCR检测miR-181a在食管癌细胞ECA109中的表达情况，结果发现miR-181a在食管癌细胞中的表达水平明显高于正常食管上皮细胞。为了进一步研究miR-181a与TGFβR2的关系，本研究将miR-181a mimics、miR-181a inhibitor转染入食管癌细胞ECA109，发现miR-181a mimics组食管癌细胞的增殖能力增强，miR-181a inhibitor增殖能力降低。并通过qRT-PCR、Western Blot检测发现 miR-181a mimics转染组TGFβR2mRNA及其蛋白的表达水平较对照组均明显降低。miR-181a inhibitor转染组TGFβR2mRNA及其蛋白的表达水平较对照组均明显升高。以上结果表明miR-181a在食管癌的发生发展过程中扮演癌基因的作用，并通过影响TGFβR2来促进食管癌细胞的增殖能力。但本研究也存在以下不足之处：首先，本研究未研究TGFβR2表达量的改变是否会影响miR-181a的表达水平。其次，本研究仅在体外实验证实这一现象，今后需要收集更多临床样本，进行体内实验以完善实验数据，并深入探讨食管癌中miR-181a、TGFβR2之间的调控机制。