miR-338-3p通过减轻炎症反应和神经细胞凋亡保护急性脑梗死脑损伤

翟文慧 冯聪 陶莉 路晶凯 祝丙华

(1解放军第三零五医院急诊科，北京 100017；2解放军总医院第一医学中心急诊科；3解放军第三零五医院医务部)

急性脑梗死是因颅内动脉血管堵塞引起脑组织供血不足所致的局部脑组织缺血性坏死，具有很高的致残率和致死率〔1〕；近年来，急性脑梗死发病率有明显升高的趋势〔2〕，严重威胁着人们的身体健康；溶栓治疗是其有效的治疗方法，但有一定的时间窗限制〔3〕；因此，寻找新的、有效的治疗手段一直是医学界研究热点。目前，急性脑梗死所致的脑组织损伤发病机制尚不明确，但与缺血、缺氧所致的炎症反应和神经细胞凋亡等密切相关〔4,5〕。微小RNA(miRNA)是一类高度保守的非编码小RNA，可通过调控相关靶基因在细胞增殖、凋亡和炎症反应等过程中发挥着重要作用，与神经系统相关疾病的发生发展密切相关〔6,7〕。有研究发现，miR-338-3p在急性脑梗死患者血浆中表达下调，且在长链非编码RNA肺腺癌转移相关转录因子(MALAT)1上调炎症因子超敏C反应蛋白表达过程中发挥着重要的抑制作用〔8〕，但其在急性脑梗死脑组织损伤中的作用机制并不清楚。本研究在构建急性脑梗死大鼠模型基础上侧脑室注射miR-338-3p激动剂，观察miR-338-3p对急性脑梗死大鼠脑组织损伤的影响及作用机制，以期为改善急性脑梗死脑组织损伤提供新线索。

1 材料与方法

1.1主要材料 清洁级SD雄性大鼠〔许可证号：SCXK(京)2018-0002，中国医学科学院医学实验动物研究所〕。miR-338-3p激动剂(货号：Agomir，百奥迈科生物技术有限公司)，2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色液、放射免疫沉淀试验(RIPA)裂解液、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3活性测定试剂盒、原位末端转移酶标记技术(TUNEL)细胞凋亡检测试剂盒、全蛋白提取试剂盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度检测试剂盒、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)试剂盒(货号：G3004、R0010、BC3830、T2190、BC3710、PC0020、P1200，北京索莱宝)，细胞间黏附分子(ICAM)-1酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(货号：PI495，上海碧云天)，血管细胞黏附分子(VCAM)-1 ELISA试剂盒(货号：WT-E4314，上海蔚霆生物科技有限公司)，兔抗鼠B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)单克隆抗体(货号：ab32124、ab32503、ab181602，英国Abcam)。

1.2大鼠模型构建及分组处理 采用改良Longa线栓法建模〔4〕：采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后，置于操作台上以仰卧式固定；在右侧颈正中处切口使颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉暴露，在颈总动脉分叉近心开口，以尼龙鱼线插入颈内动脉使动脉近端血流受阻20 min。根据Zea-Longa评分标准〔5〕，当术后大鼠行走时出现转圈、左倾斜、甚至无法直立行走等特征时说明造模成功。将建模成功的36只大鼠分为模型组、miR-NC组和miR-338-3p组，每组12只；另外，将只暴露颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，不做插入尼龙鱼线处理的12只大鼠作为假手术组。其中，miR-NC组大鼠侧脑室注射以生理盐水溶解的浓度为20 μmol/L激动剂阴性对照5 μl，miR-338-3p组大鼠侧脑室注射以生理盐水溶解的浓度为20 μmol/L miR-338-3p激动剂5 μl，而假手术组和模型组大鼠给予等量的生理盐水。

1.3大鼠神经功能评估 在术后48 h，根据Zea-Longa评分标准(不能自由行走甚至意识丧失计4分，行走时向左倾斜计3分，行走时向左转圈2分，左侧前爪未能完全伸展1分，未出现任何异常记0分)对各组大鼠的神经功能进行评估。

1.4大鼠脑梗死体积检测 上述实验完成后，各组随机选取6只大鼠行麻醉处死；取脑组织制成厚度为2 mm冠状切片；采用2%TTC室温染色15 min后，以4%多聚甲醛进行固定；其中，呈白色的为梗死组织，呈红色的为正常组织；采用Image Pro Plus 6.0软件根据公式：梗死体积(%)=100%×(切片厚度×梗死面积)/全脑体积，计算大鼠梗死体积。

1.5大鼠脑组织神经细胞凋亡相关指标检测 将各组剩余的6只大鼠麻醉处死后，留取脑组织；取适量脑组织样品制成4 μm厚度切片后，根据TUNEL试剂盒说明书检测各组大鼠脑神经细胞凋亡率。

1.6大鼠脑组织神经细胞Caspase-3活性检测 取脑组织标本，加入裂解液充分裂解后，1 000 r/min离心15 min，收集上清液并参照Caspase-3活性检测试剂盒检测大鼠脑组织神经细胞Caspase-3活性。

1.7大鼠脑组织中凋亡蛋白Bcl-2和Bax表达水平检测 取脑组织标本，加入裂解液充分裂解后，参照全蛋白提取试剂盒说明书提取组织总蛋白；采用BCA法对蛋白样品定量后，将变性蛋白行SDS-PAGE分离；电泳结束后，电转至聚偏氟乙烯膜上；以含5%脱脂奶粉的封闭液封闭2 h后，置于一抗(1∶1 000)中室温结合反应2 h；封闭液洗膜后，置于辣根过氧化酶标记的二抗(1∶2 000)中室温结合反应2 h；以化学发光剂显影曝光后，采用凝胶成像分析系统扫描分析大鼠脑组织中Bcl-2和Bax蛋白表达水平，其中GAPDH为内参进行校正。

1.8大鼠脑组织中miR-338-3p表达检测 取适量脑组织充分研磨后，采用Trizol法提取组织总RNA；采用紫外分光光度计检测RNA浓度后，根据逆转录试剂盒说明书合成cDNA；以cDNA为模板根据上海生工生物工程股份有限公司合成的引物行实时荧光定量-聚合酶链反应(PCR)扩增，2-△△Ct法计算miR-338-3p表达水平。其中，扩增条件为：94℃ 3 min；95℃ 30 s、59℃ 30 s、72℃ 30 s，循环40次；引物序列为：miR-338-3p上游：5′-TGCGGTCCAGCATCAGTGAT-3′，下游：5′-CCAGTG-CAGGGTCCGAGGT-3′；内参U6上游：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。

1.9大鼠脑组织中炎症因子VCAM-1和ICAM-1表达检测 将适量脑组织标本与9倍体积的生理盐水混合制成10%脑组织匀浆，以1 000 r/min离心15 min，收集上清液并参照ELISA试剂盒检测大鼠脑组织VCAM-1和ICAM-1含量。

1.10统计学分析 采用SPSS24.0软件进行t检验、单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1各组神经功能和脑梗死体积比较 模型组神经功能评分和脑梗死体积较假手术组明显升高(P<0.05)，而miR-NC组与模型组神经功能评分和脑梗死体积差异无统计学意义(P>0.05)；与模型组和miR-NC组比较，miR-338-3p组神经功能评分和脑梗死体积均明显降低(P<0.05)。见表1。

表1 各组神经功能评分比较

2.2转染后各组脑组织中miR-338-3p表达水平 模型组脑组织中miR-338-3p表达水平(0.25±0.03)较假手术组(0.95±0.07)明显降低(P<0.05)，而miR-NC组脑组织中miR-338-3p表达水平(0.23±0.02)和模型组差异无统计学意义(P>0.05)；但miR-338-3p组脑组织中miR-338-3p表达水平(1.37±0.11)较模型组和miR-NC组明显升高(P<0.05)。

2.3miR-338-3p对大鼠脑组织神经细胞凋亡和Caspase-3水平的影响 与假手术组比较，模型组脑组织神经细胞凋亡率和Caspase-3水平均明显升高(P<0.05)；与模型组比较，miR-NC组脑组织神经细胞凋亡率和Caspase-3水平差异均无统计学意义(P>0.05)；与miR-NC组和模型组比较，miR-338-3p组脑组织神经凋亡率和Caspase-3水平均明显降低(P<0.05)。见表2。

2.4miR-338-3p对大鼠脑组织中Bcl-2和Bax蛋白表达水平的影响 与假手术组比较，模型组脑组织中Bcl-2蛋白表达水平明显降低，而Bax蛋白表达水平明显升高(P<0.05)；与模型组比较，miR-NC组脑组织中Bcl-2和Bax蛋白表达水平差异均无统计学意义(P>0.05)；与模型组和miR-NC组比较，miR-338-3p组脑组织中Bcl-2蛋白表达水平明显升高，而Bax蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。见图1、表3。

表2 各组脑组织细胞凋亡率和Caspase-3水平比较

1～4：假手术组，模型组，miR-NC组，miR-338-3p组图1 Western印迹检测Bcl-2和Bax蛋白表达

表3 各组脑组织中Bcl-2和Bax蛋白水平比较

2.5miR-338-3p对大鼠脑组织中炎症因子VCAM-1和ICAM-1表达的影响 与假手术组比较，模型组脑组织中炎症因子VCAM-1和ICAM-1水平明显升高(P<0.05)；与模型组比较，miR-NC组脑组织中VCAM-1和ICAM-1水平差异均无统计学意义(P>0.05)；与模型组和miR-NC组比较，miR-338-3p组VCAM-1和ICAM-1水平均明显降低(P<0.05)。见表4。

表4 各组脑组织中VCAM-1和ICAM-1水平比较

3 讨 论

miRNAs是一类在机体内广泛分布的非编码RNA，可通过与靶基因特异性互补配对而发挥重要的基因调控作用，其异常表达与脑血管疾病、癫痫和肿瘤形成等疾病的发生发展密切相关〔9〕。在急性脑梗死患者中存在异常表达的miRNAs〔10,11〕，而部分miRNAs可通过调控神经细胞凋亡和炎症反应等参与脑组织损伤〔12，13〕。miR-338-3p在急性脑梗死患者血浆中表达下调〔8〕，但其在急性脑梗死脑组织损伤中的作用并不清楚。

作为miRNAs家族成员，miR-338-3p不仅参与肿瘤细胞凋亡，而且其低表达还与神经细胞凋亡密切相关〔14,15〕。本研究结果表明，miR-338-3p过表达可通过调控Bcl-2、Bax和Caspase-3表达减轻神经细胞凋亡，改善急性脑梗死大鼠脑组织损伤。提示，miR-338-3p在急性脑梗死脑组织损伤中起着重要的保护作用，其作用机制与抑制神经细胞凋亡有关。

另外，miR-338-3p在细胞炎症反应过程中发挥着重要作用。miR-338-3p可通过抑制细胞外信号调节激酶(ERK)/P38信号通路下调炎症因子VCAM-1和ICAM-1表达减轻炎症反应〔16〕。VCAM-1和ICAM-1是黏附分子的免疫球蛋白超家族成员，其表达升高可促进单核细胞转化为炎症巨噬细胞，分泌促炎因子，在白细胞活化、黏附和渗出等过程中发挥着重要作用〔17,18〕。在急性脑梗死患者中存在着VCAM-1和ICAM-1高表达，而抑制其表达可减弱炎症反应，缓解脑组织损伤〔19,20〕。本研究结果表明，miR-338-3p过表达可通过降低VCAM-1和ICAM-1表达减轻其介导的脑组织炎症损伤。提示，miR-338-3p可能通过减轻脑组织炎症损伤发挥神经保护作用。

综上，miR-338-3p可通过减轻炎症反应和神经细胞凋亡保护急性脑梗死大鼠脑组织损伤。本研究从炎症和细胞凋亡角度初步揭示了miR-338-3p的神经保护作用，其具体的抗炎和抗凋亡机制还有待进一步深入探讨。