外源SLs和纳米K2MoO4对干旱胁迫下油菜种子萌发的影响

庞星月 万 林 李 素 王宇航 刘 晨 肖晓璐 李心昊 马 霓

（中国农业科学院油料作物研究所/农业农村部油料作物生物学与遗传育种重点实验室，430062，湖北武汉）

油菜是我国第一大油料作物，年种植面积达600万hm2以上，其中长江流域约占85%[1]，近年来以直播种植方式为主[2]。然而南方秋冬季节干旱频繁，油菜播种后容易出现出苗慢、出苗不齐、冬前弱苗和死苗等现象，难以实现壮苗齐苗，导致油菜籽产量和种植效益下降，影响了农民的种植积极性，产生大量的冬闲田[3-4]。因此，解决干旱胁迫下油菜种子萌发和出苗困难等问题，对扩大油菜种植面积、减少冬闲田、提高我国食用油供给能力具有重要意义。

独脚金内酯（SLs）是一组类胡萝卜素衍生的倍半萜激素，可诱导寄生性杂草的种子萌发[5]，在调控植物对生物和非生物胁迫的反应中发挥着重要作用[6]。Van等[7]研究证明，在拟南芥中，SLs是植物对非生物胁迫（如盐和干旱胁迫）的正向调节因子。在盐胁迫条件下，外源SLs可以增加油菜叶片抗氧化物酶活性，降低活性氧含量，促进油菜幼苗生长[8]。并且SLs能显著提高干旱胁迫下谷子发芽率和抗旱指数[9]。万林等[10]研究发现，0.18μmol/L SLs处理能加快干旱条件下油菜叶绿素合成，提高叶片抗氧化能力，有效增强油菜苗期抗旱性。

纳米材料具有独特的物理及化学特性[11]，与传统化学药剂相比，更安全高效且不易产生抗药性，被广泛应用于纳米农药、种子包衣剂和纳米肥料等农业生产中[12]。姜余梅等[13]发现，适当浓度的碳纳米管可以促进水稻种子发芽和根系生长，可提高根系活力。外施富勒烯对油菜种子萌发有显著促进作用[14]。纳米钼酸钾（n-K2MoO4）作为一种新型纳米材料，近年来，在金属防锈颜料、化学催化、抗菌材料、电极电池材料、荧光材料、阻燃抑烟剂及闪烁探测等方面已有良好应用[15]，本团队前期研究认为n-K2MoO4可以增加油菜对菌核病的抗性，提高产量，且与农药混合配施能提高药效（未发表）。因此，为促进2种物质在油菜生产上的应用，本研究采用添加外源SLs和n-K2MoO4处理，比较干旱胁迫下油菜种子萌发过程中形态和生理指标的变化规律，探讨调控种子萌发和抗旱性的生理机制，为油菜栽培技术和产品研发转化奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料是甘蓝型油菜品种Q2（抗旱型）和秦优8号（干旱敏感型），分别由中国农业科学院油料作物研究所和咸阳市农业科学院提供。SLs类似物GR24（纯度≥98%）购于上海翊圣生物有限公司。

1.2 试验方法

挑选大小一致、形态饱满的种子，用75%酒精消毒10s，5%次氯酸钠消毒5min，蒸馏水漂洗数次，用滤纸吸干水分。将消毒后的种子置于铺有3层滤纸、直径为90mm的玻璃培养皿内。每皿60粒种子，每个处理3个培养皿，3次重复，加入6mL处理液。用聚乙二醇6000（PEG）模拟干旱胁迫，根据SLs、n-K2MoO4和SLs+n-K2MoO4各4个浓度梯度的预试验结果，分别设置处理液为蒸馏水（CK1），15% PEG（CK2），0.10µmol/L GR24+15% PEG（T1），0.24mmol/Ln-K2MoO4+15% PEG（T2），0.10µmol/L GR24+0.24mmol/L n-K2MoO4+15% PEG（T3），SLs和n-K2MoO4溶于15% PEG溶液中。将培养皿放到人工气候箱（三洋MLR-350）中，在光照/黑暗25℃16h/20℃8h、湿度70%条件下发芽。每2d更换底部滤纸，加入各处理液5mL。试验重复多次，7d后取样测定幼苗农艺性状和生理指标。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 发芽率、发芽指数和活力指数 每天观察并统计供试材料发芽情况，以胚根长度不小于种子直径一半作为发芽标准。以幼茎直立，子叶平展，子叶由淡黄转为绿色为出苗标准。各指标计算方法[14]如下：发芽率（germination rate，GR，%）=发芽数/供试种子数×100；平均发芽时间（mean germination time，MT）=∑(ni×di/n)，式中，ni为第i天发芽种子数，di为开始播种天数，n为发芽的种子总数；发芽指数（germination index，GI）=(n1/1)+(n2/2)+…(ni/i)，式中，n1，n2，…，ni为第1，2，…，i天发芽数量；活力指数（vigour index，VI）=发芽率×（根长+胚芽长）。

1.3.2 胚根长、侧根数及干重 发芽7d后取长势一致的10棵幼苗，分别测定苗高、胚根长和侧根数。测量完后将子叶和胚根放入烘箱中，105℃杀青30min，80℃烘干至恒重，称地上和地下干重。所有性状取10个幼苗的平均值。

1.3.3 叶绿素含量 采用分光光度法测定幼苗叶片叶绿素含量，叶绿素a（Chl a）、叶绿素b（Chl b）和类胡萝卜素分别在665、649和470nm有最大吸收峰。取0.2g叶片，用95%乙醇提取油菜叶片叶绿素，根据分光光度计测定的吸光值，计算叶绿素含量[16]。

1.3.4 生理指标 幼苗叶片超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）活性及丙二醛（MDA）、过氧化氢（H2O2）、超氧阴离子（O-2·）、脯氨酸（Pro）和可溶性糖（SS）含量均由北京索莱宝科技有限公司的相应试剂盒测定，每个指标重复3次。SOD、POD和MDA测定试剂盒所用提取液为同一种，可同时测定。以上测量指标所用样品质量分别为0.1g，测定步骤严格按照试剂盒说明书操作。

1.4 数据处理

利用Microsoft Excel 2007录入数据和计算，利用SigmaPlot 10.0软件绘图，SPSS 17.0软件进行数据的单因素方差分析（One-way ANOVA）和相关性分析（pearson correlation coefficient），采用LSD法测验α＜0.05水平上的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 干旱胁迫和生长调节物质对油菜种子萌发性状的影响

由表1可知，与CK1处理相比，干旱胁迫（CK2）显著降低了秦优8号种子GR，使2个品种的种子发芽时间增加。CK2处理Q2和秦优8号的GR、GI、VI与对照（CK1）比均有所降低。CK2处理下，Q2种子GR、GI、VI和出苗率分别比CK1处理降低了1.11%、47.50%、90.02%和63.63%；秦优8号相应指标分别降低了59.33%、85.45%、96.36%和82.76%。干旱胁迫（CK2）下，Q2的GR、GI、VI和出苗率均显著高于秦优8号。

表1 干旱和SLs、n-K2MoO4对干旱胁迫下油菜种子萌发性状的影响Table 1 Effects of drought and SLs、n-K2MoO4on the germination traits of rapeseed under drought stress

外源SLs和n-K2MoO4处理后种子GR、GI和VI明显高于CK2处理（表1），其中T3处理促进种子出苗效果最好，Q2种子GR、GI、VI和出苗率比CK2处理分别提高1.12%、65.97%、268.79%和114.03%；秦优8号的T3处理比CK2处理分别提高143.15%、512.78%、1027.13%和196.58%。

2.2 干旱胁迫和生长调节物质对油菜幼苗农艺性状的影响

由表2可知，PEG胁迫使Q2和秦优8号的干重、主根长、侧根数和侧根长与CK1处理相比均有降低。Q2种子幼苗干重、主根长、侧根长和侧根数分别比CK1处理（正常条件）降低了17.57%、81.08%、84.20%和75.00%；秦优8号相应指标分别降低了20.65%、71.05%、92.36%和85.71%，差异均达到显著水平（P＜0.05）。

表2 干旱和SLs、n-K2MoO4对干旱胁迫下油菜幼苗农艺性状的影响Table 2 Effects of drought and SLs、n-K2MoO4on the agronomic traits of rape seedlings under drought stress

T1、T2和T3处理下2个品种的种子主根长、侧根数及幼苗生长势均与CK2（干旱胁迫）有显著性差异。T1处理下，Q2的干重、主根长、侧根长和侧根数分别比CK2处理提高了47.07%、774.29%、183.04%和400.00%；秦优8号相应指标分别比CK2处理提高了27.57%、430.24%、1021.88%和1000.00%，差异均达到显著水平（P＜0.05）。

2.3 干旱胁迫和生长调节物质对幼苗叶片叶绿素含量的影响

由表3可知，大部分干旱处理显著降低了油菜叶片的叶绿素含量。Q2的Chl a、Chl b、Chl a+b和Chl a/Chl b的降低率分别为19.15%、12.73%、17.03%和7.39%；秦优8号分别为19.32%、16.62%、18.33%和3.51%。干旱胁迫下，外源SLs和n-K2MoO4显著降低了叶绿素含量的降低幅度，其中T2处理的作用更明显，Q2的Chl a、Chl b、Chl a+b和Chl a/Chl b分别增加了39.06%、23.18%、33.54%和12.77%；秦优8号分别为45.52%、44.11%、44.87%和3.64%，差异均达到显著水平（P＜0.05）。

表3 干旱和SLs、n-K2MoO4对干旱胁迫下油菜叶片叶绿素含量的影响Table 3 Effects of drought and SLs、n-K2MoO4on chlorophyll content of rape seedlings under drought stress mg/g FW

2.4 干旱胁迫和生长调节物质对油菜幼苗叶片抗氧化酶活性的影响

如图1所示，干旱胁迫提高了SOD和POD活性，与CK1处理相比，Q2幼苗叶片SOD和POD活性分别提高了14.03%和193.33%，秦优8号分别提高了11.53%和51.29%。在15% PEG中加入SLs、n-K2MoO4的处理能显著提高这2种酶的活性，T1处理与CK2处理相比，Q2幼苗叶片SOD和POD活性分别增加了21.44%和58.00%；秦优8号SOD和POD活性分别增加了26.50%和44.23%。T2与CK2处理相比，Q2中SOD和POD活性分别增加了22.81%和37.69%；秦优8号中SOD和POD活性分别增加了15.72%和45.63%。T3与CK2处理相比，Q2中SOD和POD活性分别增加了38.78%和36.69%；秦优8号中SOD和POD活性分别增加了33.52%和324.04%。

图1 干旱和SLs、n-K2MoO4处理对油菜叶片SOD和POD活性的影响Fig.1 Effects of drought and SLs,n-K2MoO4on the SOD and POD activities of oilseed rape leaves

2.5 干旱胁迫和生长调节物质对油菜幼苗叶片活性氧含量的影响

由图2可知，15% PEG显著提高了油菜子叶中的活性氧含量，与对照处理相比，Q2子叶中O-2·、H2O2和MDA含量分别上升了91.62%、49.86%和517.42%，秦优8号分别上升了192.18%、48.56%和559.62%。在15% PEG中加入SLs、n-K2MoO4的处理显著降低了O-2·的含量，T1与CK2处理相比，Q2的O-2·、H2O2和MDA含量分别减少了37.73%、16.10%和23.10%；秦优8号中三者含量分别减少了56.14%、21.04%和62.89%。T2与CK2处理相比，Q2中O-2·、H2O2和MDA含量分别减少了34.49%、21.06%和31.92%；秦优8号中三者含量分别减少了46.20%、10.37%和49.69%。T3与CK2处理相比，Q2中O-2·、H2O2和MDA含量减少了40.81%、14.82%和74.11%；秦优8号中三者含量分别减少了54.01%、23.52%和75.22%。

图2 干旱和SLs、n-K2MoO4处理对油菜叶片活性氧含量的影响Fig.2 Effects of drought and SLs,n-K2MoO4on the active oxygen contents of oilseed rape leaves

2.6 干旱胁迫和生长调节物质对油菜幼苗叶片渗透调节物质含量的影响

与正常处理相比，渗透胁迫提高了叶片中SS和Pro含量（图3），Q2分别增加了79.34%和674.31%；秦优8号分别增加了10.34%和348.05%。SLs、n-K2MoO4处理提高SS和Pro含量，T1与CK2处理相比，Q2叶片中SS和Pro含量分别提高了20.64%和57.93%；秦优8号叶片中SS和Pro含量分别提高了42.67%和197.81%。T2与CK2处理相比，Q2叶片中SS和Pro含量分别提高了38.07%和48.28%；秦优8号叶片中SS和Pro含量分别提高了22.62%和158.73%。T3与CK2处理相比，Q2叶片中SS和Pro含量分别提高了63.35%和157.03%；秦优8号叶片中SS和Pro含量分别提高了21.75%和292.15%。

图3 干旱和SLs、n-K2MoO4处理对油菜叶片SS和Pro含量的影响Fig.3 Effects of drought and SLs,n-K2MoO4on soluble sugar and proline contents of rape leaves

2.7 干旱胁迫下种子萌发相关指标与幼苗生理指标相关性分析

由表4可知，种子萌发相关指标中GR、GI、VI与DW之间存在极显著或显著正相关，与平均发芽时间为极显著负相关（P＜0.01）。种子萌发相关指标（GR、GI和VI）与 MDA、H2O2和 O-2·之间存在极显著负相关（P＜0.01）。Pro和SS含量与DW、SOD、POD活性为显著或极显著正相关，但和LRL为极显著负相关（P＜0.01）。

表4 种子萌发相关指标与幼苗生理指标的相关系数Table 4 Correlation coefficients between seed germination parameters and physiological indexes in seedlings

3 讨论

种子萌发是植物生长过程中的起始阶段，也是保证出苗的前提[17]。而干旱会常造成油菜种子发芽延缓、生长缓慢和干物质积累减少[18-19]。作物萌发期干旱常用高渗溶液模拟，如聚乙二醇、甘露醇和蔗糖等，15%浓度以上的PEG能显著抑制作物种子发芽率、发芽指数及幼苗生物量[20]。胡承伟等[21]发现，14% PEG渗透胁迫明显抑制油菜根鲜重和侧根数目。这些与本研究结果一致。另外，本研究发现干旱胁迫严重影响根长生长，而且抗旱性品种Q2在干旱胁迫下具有较高的GR、GI和VI。

MDA是膜脂过氧化的主要产物之一[22]，可作为植物细胞膜损伤程度的指标[23]。干旱胁迫在细胞水平上显著加速ROS的生成[24-26]，ROS的自由基主要包括O-2·、过羟基自由基（HO2）和烷氧自由基（RO），而H2O2和单线态氧（O2）则以非自由基的分子形式存在[27-28]。本萌发试验结果表明，干旱胁迫下，与正常供水相比，Q2子叶中MDA和O-2·含量上升幅度低于秦优8号，说明抗旱油菜品种受干旱伤害较轻。SOD是超氧化物的主要清除剂，产生H2O2，由POD通过酚类化合物或抗氧化剂分解H2O2[28-29]，从而提高植物抗旱能力。本研究在干旱处理后，2个油菜品种SOD和POD活性显著上升。Pro和SS通过降低细胞渗透势来维持细胞膨压，防止细胞脱水，减轻逆境对细胞的伤害[30]。本研究结果表明干旱处理后抗旱品种Q2的Pro和SS含量较高。

SLs可以促进种子萌发，调控根系构型，增加根毛长度，促进次生生长[31-32]，外施SLs可显著缓解上述干旱胁迫对植物造成的伤害。纳米材料因独特的物理和化学特性广泛应用于植物生产中，可刺激植物生长，改善植物的生长环境，促进植物代谢[33]。本研究中SLs和n-K2MoO4分别处理以及SLs+n-K2MoO4处理显著缓解了干旱对敏感品种油菜种子萌发的抑制，尤其是SLs+n-K2MoO4对油菜种子GR的促进作用最大。而本研究中SLs+n-K2MoO4互作对种子根长和侧根数的促进作用小于SLs和n-K2MoO4各自处理，其作用机制需要进一步研究。

Mojde等[32]发现，SLs处理的植物对干旱胁迫有较强的耐受性，具有较高的抗氧化物酶活性和渗透调节物质。纳米材料可促进逆境胁迫下植物SOD、POD和CAT活性升高[33]。本研究中，SLs、n-K2MoO4处理后各油菜品种 MDA、H2O2、O-2·含量都显著下降，说明SLs和n-K2MoO4对干旱造成的MDA、H2O2和O-2·含量升高具有抑制作用，SLs和n-K2MoO4可以缓解干旱对油菜幼苗伤害。另外，SLs和n-K2MoO4提高油菜幼苗SOD、POD活性和SS、Pro含量，也从侧面说明油菜幼苗抗旱性有所增强。其中0.10µmol/LGR24+0.24mmol/Ln-K2MoO4对SOD和POD活性的促进作用以及对MDA含量的抑制效果更加明显。

4 结论

抗旱品种Q2在干旱胁迫后种子GR、GI、VI、出苗率、芽长及SOD、POD活性、SS、Pro含量高于干旱敏感型品种秦优8号，MDA、H2O2、O-2·含量低于秦优8号。SLs、n-K2MoO4对干旱引起的种子出苗率低和幼苗生长慢等现象均有一定的缓解作用，SLs主要促进种子根系生长和侧根分化，n-K2MoO4主要增加了叶片叶绿素含量，而SLs+n-K2MoO4处理对干旱胁迫下种子萌发出苗和缓解细胞氧化损伤的效应较好。