含氢化诺卜基的季铵盐类化合物对松枯梢病原菌的抑制作用及其机理研究

昌家宇，丁清颖，肖转泉，王宗德，张 骥，陈尚钘*

(1.江西农业大学 林学院；国家林业草原木本香料(华东)工程技术研究中心，江西 南昌 330045；2.江西师范大学 化学化工学院，江西 南昌 330027)

松枯梢病是一种世界性林木病害，是分布范围最广的林木真菌病害之一，它使许多国家的松树人工林受到巨大损失。据统计，全世界已有近30个国家报道了松枯梢病的发生与危害[1]。1999年，松枯梢病在中国多省引起了松树大面积枯死的现象，造成了较大的经济损失，因此研究人员把松枯梢病列为中国重要的森林病害并进行深入研究[2]。在中国，引起松枯梢病的病原菌主要是松球壳孢菌(Sphaeropsissapinea)，该菌株适宜在24～28 ℃、pH值6.0条件下生长，对樟子松、马尾松、湿地松、火炬松、多脂松等都有很大的危害，它会引起顶芽、新梢及丛枝枯死，枝干溃疡、变褐等发病症状[3]。目前，在松枯梢病的防治方面，主要有营林技术措施、化学防治和生物防治。其中化学防治是较为常用且实用的方法，能快速及时地防止病情的传播，是林间常用的防控方法，所用的化学药剂有波尔多液、苯醚甲环唑和多菌灵等药剂[4]。据文献报道，25%的苯醚甲环唑对樟子松枯梢病病原菌菌丝生长及孢子萌发能起到较好的抑制作用[5]；77%氢氧化铜可湿性粉剂及50%多菌灵可湿性粉剂对松枯梢病的抑制效果较好[6]。

松节油是我国产量较大的天然产物之一，其主要成分α-蒎烯和β-蒎烯是很好的林产化工原料。王宗德等在α-蒎烯和β-蒎烯的深加工化学利用方面，合成了许多系列的衍生物。研究发现由α-蒎烯作原料合成的(E)-莰烯醛肟及其烷基醚[7]、莰烯腈[8]、内型异莰烷基甲醛肟[9]，以及由β-蒎烯作原料合成的氢化诺卜基季铵盐[10-11]等对松枯梢病原菌都具有显著的抑制作用。季铵盐类化合物是一类性能优良的阳离子表面活性剂，具有化学性能稳定、广谱抗菌、低毒高效和使用方便等优点；开发新型植物源季铵盐类化合物，对于新型绿色高效植物源抑菌剂的开发和应用都具有十分重要的意义。因此，本研究采用菌丝生长速率法就含单氢化诺卜基的单季铵盐、含双氢化诺卜基的单季铵盐与含双氢化诺卜基的双子季铵盐三个系列共36种化合物对松枯梢病原菌(S.sapinea)生长的抑制率作了测定与对比，并选择其中4种化合物进行抑菌机理试验，以期为氢化诺卜基季铵盐类化合物开发成为有效杀灭松枯梢病原菌的化学品提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 氢化诺卜基季铵盐类化合物的来源

13个含单氢化诺卜基的单季铵盐，由氢化诺卜基二烷基叔胺和卤代烃反应合成得到[12-13]，分别为氢化诺卜基二甲基乙基溴化铵(1)、氢化诺卜基二甲基丙基溴化铵(2)、氢化诺卜基二甲基正丁基溴化铵(3)、氢化诺卜基二甲基正戊基溴化铵(4)、氢化诺卜基二甲基乙基碘化铵(5)、氢化诺卜基二甲基丙基碘化铵(6)、氢化诺卜基二甲基正丁基碘化铵(7)、氢化诺卜基二乙基丙基溴化铵(8)、氢化诺卜基二乙基正丁基溴化铵(9)、氢化诺卜基二乙基正戊基溴化铵(10)、氢化诺卜基二乙基正癸基溴化铵(11)、氢化诺卜基二乙基丙基碘化铵(12)、氢化诺卜基二乙基正丁基碘化铵(13)。

5个含双氢化诺卜基的单季铵盐，由氢化诺卜基卤代物和含氢化诺卜基的叔胺反应合成得到[10]，分别为：双氢化诺卜基二甲基溴化铵(14)、双氢化诺卜基二甲基碘化铵(15)、双氢化诺卜基二乙基溴化铵(16)、双氢化诺卜基二乙基碘化铵(17)、N,N-双氢化诺卜基溴化哌啶(18)。

余下18个含双氢化诺卜基的双子季铵盐，由氢化诺卜基二烷基叔胺和α,ω-二卤代烷反应合成得到[11,14-15]，分别为：二亚甲基-1,2-双(氢化诺卜基二甲基溴化铵)(19)、三亚甲基-1,3-双(氢化诺卜基二甲基溴化铵)(20)、四亚甲基-1,4-双(氢化诺卜基二甲基溴化铵)(21)、五亚甲基-1,5-双(氢化诺卜基二甲基溴化铵)(22)、六亚甲基-1,6-双(氢化诺卜基二甲基溴化铵)(23)、四亚甲基-1,4-双(氢化诺卜基二甲基氯化铵)(24)、五亚甲基-1,5-双(氢化诺卜基二甲基氯化铵)(25)、六亚甲基-1,6-双(氢化诺卜基二甲基氯化铵)(26)、三亚甲基-1,3-双(氢化诺卜基二乙基溴化铵)(27)、四亚甲基-1,4-双(氢化诺卜基二乙基溴化铵)(28)、(五亚甲基-1,5-双(氢化诺卜基二乙基溴化铵)(29)、六亚甲基-1,6-双(氢化诺卜基二乙基溴化铵)(30)、1,4-二苄基-双(氢化诺卜基二甲基溴化铵)(31)、1,4-二苄基-双(氢化诺卜基二乙基溴化铵)(32)、1,4-二苄基-双(氢化诺卜基二丙基溴化铵)(33)、1,4-二苄基-双(氢化诺卜基二甲基氯化铵)(34)、1,4-二苄基-双(氢化诺卜基二乙基氯化铵)(35)、1,4-二苄基-双(氢化诺卜基二丙基氯化铵)(36)。

3个系列共36种含氢化诺卜基的季铵盐类化合物均为江西农业大学林产化工研究所提供，结构通式如图1所示。

1.R=C2H5, X=Br; 2.R=C3H7, X=Br; 3.R=n-C4H9, X=Br; 4.R=n-C5H11, X=Br; 5.R=C2H5, X=I; 6.R=C3H7, X=I; 7.R=n-C4H9, X=I; 8.R=C3H7, X=Br; 9.R=n-C4H9, X=Br; 10.R=n-C5H11, X=Br; 11.R=n-C10H21, X=Br; 12.R=C3H7, X=I; 13.R=n-C4H9, X=I; 14.R=CH3, X=Br; 15.R=CH3, X=I; 16.R=C2H5, X=Br; 17.R=C2H5, X=I; 18.R,R=CH2(CH2)3CH2, X=Br; 19.R=CH3, X=Br, M=(CH2)2; 20.R=CH3, X=Br, M=(CH2)3; 21.R=CH3, X=Br, M=(CH2)4; 22.R=CH3, X=Br, M=(CH2)5; 23.R=CH3, X=Br, M=(CH2)6; 24.R=CH3, X=Cl, M=(CH2)4; 25.R=CH3, X=Cl, M=(CH2)5; 26.R=CH3, X=Cl, M=(CH2)6; 27.R=C2H5, X=Br, M=(CH2)3; 28.R=C2H5, X=Br, M=(CH2)4; 29.R=C2H5, X=Br, M=(CH2)5; 30.R=C2H5, X=Br, M=(CH2)6; 31.R=CH3, X=Br, M=1,4-CH2-C6H4-CH2; 32.R=C2H5, X=Br, M=1,4-CH2-C6H4-CH2; 33.R=C3H7, X=Br, M=1,4-CH2-C6H4-CH2; 34.R=CH3, X=Cl, M=1,4-CH2-C6H4-CH2; 35.R=C2H5, X=Cl, M=1,4-CH2-C6H4-CH2; 36.R=C3H7, X=Cl, M=1,4-CH2-C6H4-CH2

1.2 试剂与仪器

百菌清和多菌灵，均为市售产品。松球壳孢菌(Sphaeropsissapinea)，由江西农业大学林学院森林保护教研室提供。

LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；SW-CJ-10无菌超净工作台，苏州净化设备有限公司；CHP-250智能培养箱，上海三发科学仪器公司；Quanta250扫描电子显微镜(SEM)，美国FEI公司；UV-5500紫外分光光度计，上海元析仪器有限公司；DDS-307电导率仪，上海精密科学仪器有限公司。

1.3 化合物抑菌活性的测定

采用菌丝生长速率法[16]测试化合物对松枯梢病原菌的抑菌活性。以98%百菌清和多菌灵作为阳性对照，不加任何化合物的PDA培养基平板作为空白对照。将化合物用无菌水配制成质量浓度为1 g/L的溶液，通过二倍稀释法得到5个浓度梯度的溶液，将其与灭菌过的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基以一定的体积比混合，得到质量浓度为200、100、50、25和12.5 mg/L的含药培养基，每组重复3次。接菌后置于25 ℃恒温培养箱中培养数天，待空白对照组平板的菌落直径生长至整个培养皿的2/3左右，用十字交叉法测量其菌落直径，根据直径计算得到化合物对菌丝生长的抑制率，计算公式如下：

校正直径=菌落平均直径-菌饼直径(0.5 cm)

采用DPS 7.0建立毒力回归方程，以化合物质量浓度的对数值为横坐标(x)，抑制率转换的机率值为纵坐标(y)，毒力回归方程为：y=a+bx，当y=50%时，求出其抑菌的半数有效质量浓度(EC50)。

1.4 化合物抑菌机理探究

1.4.1菌丝生长量的测定 经马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基培养的菌饼与灭菌过的50 mL马铃薯葡萄糖培养基置于锥形瓶中在摇床进行培养，培养至对数生长期时分别加入10 mL的4种化合物药液，使其终浓度为相应的EC50值，以无菌水替代药液作空白对照，并继续培养至生长稳定期。将菌丝进行抽滤并用无菌水洗涤，置于恒温干燥箱中干燥至质量恒定并称质量，得到菌丝干质量[17]。

1.4.2细胞膜通透性测定 将处于生长稳定期的松枯梢病菌菌丝进行抽滤并用无菌水洗涤，得到新鲜菌丝。称取0.5 g松枯梢病菌菌丝于50 mL烧杯中，并分别加入10 mL EC50浓度下的化合物药液，以无菌水替代药液作空白对照。选用电导率仪分别测定药液处理0、20、40、60、80、100、120、140、160和180 min后的菌丝电导率，最后置于沸水中加热进行死处理5 min后测定其电导率。每组样品重复测定3次，以相对电导率(η)来表示细胞膜通透性[18]，计算公式如下：

式中：C1—处理不同时间后的电导率，S/m；C0——0 min时的电导率，S/m；C死处理—死处理时的电导率，S/m。

1.4.3SEM分析 将4个化合物用无菌水配制成的溶液与灭菌过的PDA培养基以一定的体积比混合，得到最终质量浓度为相应EC50值的含药培养基，接菌后置于25 ℃恒温培养箱中培养数天。选用经EC50浓度处理的松枯梢病菌菌丝作为电镜观察对象，挑取少许的菌丝于干净的盖玻片上置于离心管中，加入2.5%戊二醛进行固定；固定后用0.1 mol/L、pH值为7.0的磷酸缓冲液漂洗，去除多余的戊二醛；再用5个梯度浓度(50%、70%、80%、90%和95%)的乙醇溶液进行脱水，每个浓度处理15 min，再用无水乙醇处理2次，每次处理10 min；脱水结束后取出盖玻片，自然干燥，置于干燥器中保存；最后经喷金处理后便可上镜观察[19]。

2 结果与讨论

2.1 化合物对松枯梢病原菌的抑制作用

含单氢化诺卜基的单季铵盐(1～13)、含双氢化诺卜基的单季铵盐(14～18)和含双氢化诺卜基的双子季铵盐(19～36)共36个化合物，以及百菌清、多菌灵在药液质量浓度为50 mg/L时，对松枯梢病原菌的抑制率、毒力回归方程和EC50值见表1。从表1数据来看，在药液质量浓度为50 mg/L时，含双氢化诺卜基的单季铵盐、含双氢化诺卜基的双子季铵盐对松枯梢病原菌的抑制率均比百菌清和多菌灵高，大多数化合物的抑制率都在90%以上，其中还有18个化合物的抑制率高达100%。由表1还可以看出，含氢化诺卜基的双子季铵盐类化合物对松枯梢病原菌的抑制率都很高，除36(73.75%)外，几乎都达100%；双氢化诺卜基的单季铵盐，有溴离子的化合物(14、16、18)抑菌率都达100%。文献[20]报道50%多菌灵可湿性粉剂对松枯梢病原菌有明显的防治效果。本研究所用的药液质量浓度为50 mg/L，相当于1 g化合物要稀释到20 000倍。从表1数据可以看出，含氢化诺卜基的双子季铵盐对松枯梢病原菌的抑制效果均明显强于含氢化诺卜基的单季铵盐，且大多数双子季铵盐的EC50值均低于对照样百菌清和多菌灵。

表1 季铵盐类化合物对松枯梢病菌的抑制率、EC50及毒力回归方程

根据以上抑菌作用分析，含双氢化诺卜基的单季铵盐和双子季铵盐对松枯梢病原菌的抑制效果明显，因此选用了不同类型的具有明显抑菌效果的4种化合物：14、26、28和31，从菌丝干质量、细胞膜通透性以及菌丝结构3个方面，来初步探究其对松枯梢病菌的抑菌机理。

2.2 4种化合物对松枯梢病菌的抑菌机理研究

2.2.1对菌丝干质量的影响 经不同化合物处理后的菌丝干质量结果见图2，结果发现4种化合物处理后的菌丝干质量均低于空白对照组，且造成了不同程度的抑制效果。例如化合物31的抑制效果最为明显，抑制率达到了50%以上；其次是化合物26，抑制率为23.67%。由此可知，4种化合物能够在一定程度上抑制松枯梢病菌菌丝的生长。

图2 药液处理后的松枯梢病菌菌丝干质量变化

2.2.2对细胞膜通透性的影响 4种化合物对松枯梢病菌细胞膜通透性的作用结果见图3。由图可知，处理组与空白对照组的相对电导率随着时间的推移均不同程度的升高，且处理组的相对电导率均高于空白对照组。因此，可以看出4种化合物对松枯梢病菌细胞膜造成了不同程度的损伤。当药液处理60 min时，4种化合物的相对电导率都远远高于空白对照组，其中14的相对电导率为27.0%，是空白对照组的2倍。由以上结果可以推测化合物破坏了松枯梢病菌细胞膜的完整性，增加了细胞膜的通透性，从而导致相对电导率显著升高。

2.2.3对菌丝体形态和细胞结构的影响 经4种化合物处理后松枯梢病菌菌丝的扫描电镜图见图4。由图可知，空白对照组(图4(e))的松枯梢病菌菌丝细胞结构完整清晰，呈圆柱形，菌丝体光滑均匀；而经4种化合物处理的松枯梢病菌菌丝体(图4(a)～图4(d))形态和细胞结构发生了显著变化，菌丝出现扭曲，表面褶皱明显，菌丝体粗细不一，甚至在局部菌丝体表面有脊状突起。推测4种化合物均可以改变松枯梢病菌菌丝体形态，从而可能破坏菌丝体的细胞壁和细胞膜结构，最终导致菌丝死亡。

a.14; b.26; c.28; d.31; e.CK

3 结 论

3.1采用菌丝生长速率法测试了含单氢化诺卜基的单季铵盐、含双氢化诺卜基的单季铵盐和含双氢化诺卜基的双子季铵盐共36种化合物对松枯梢病菌的抑制率，结果表明：在质量浓度为50 mg/L时，含双氢化诺卜基的季铵盐对松枯梢病菌具有明显的抑制效果，抑制率均高于阳性对照百菌清和多菌灵，且双子季铵盐的抑制效果明显强于单季铵盐。

3.2从松枯梢病菌菌丝干质量、细胞膜通透性以及菌丝结构3个方面初步探究了4种化合物对松枯梢病菌的抑制机理，结果表明：经14、26、28和31这4种化合物处理后的松枯梢病菌的菌丝干质量减少，说明4种化合物均一定程度地抑制了菌丝的生长；相比空白对照，4种化合物处理后的相对电导率明显升高，说明化合物破坏了松枯梢病菌细胞膜的完整性；扫描电镜分析发现，处理后的菌丝体形态和细胞结构发生了明显改变。本研究初步探究了含氢化诺卜基季铵盐对松枯梢病菌的抑菌机理，后续可从核酸、蛋白质以及酶活性等多方面进一步深入研究。