血清S100A8/A9水平与上尿路草酸钙结石的关系

(右江民族医学院附属医院泌尿外科，广西 百色 533000)

泌尿系结石是泌尿系统疾病常见病之一，根据相关调查结果显示，我国泌尿系结石的发病率已经超过6%，在我国南部各地区发病率则达到11.6%[1]。近年来，发病率呈上升趋势，并且超过一半的患者在经过有效治疗后5年内再次复发[2]。钙卫蛋白(calprotectin，S100A8/A9)作为结石基质蛋白(stone matrix proteins，SMP)，属于S100蛋白家族中的一类同源低分子量钙结合蛋白，通常是由钙粒蛋白A与钙粒蛋白B以钙离子依赖性方式形成的异源二聚体蛋白复合物，有研究显示，S100A8/A9在炎症反应、肿瘤生长与转移、调节细胞循环等生理过程中扮演着重要角色[3-4]。目前已有相关临床及基础研究提示草酸钙结石的形成可能是炎症反应所致，尿液中各类晶体等成分与肾小管上皮细胞发生相互作用，从而引起肾小管上皮损伤和炎症反应，而这些病理过程往往与草酸钙结石形成的关系密切[5]。而S100A8/A9作为炎性细胞因子，在血管内皮细胞、成纤维细胞和巨噬细胞等各类细胞中广泛表达，不论是在细胞内还是细胞外，均具有生物学活性从而发挥生物学效应[6-7]。目前国内外关于血清S100A8/A9水平与上尿路上尿路草酸钙(calcium oxalate，CaOx)结石之间的关系少见明确的定论。本实验通过对血清中S100A8/A9表达水平与上尿路草酸钙结石之间的相互关系进行研究，并对其出现的表达差异进行初步讨论，为往后更深入的研究草酸钙结石的生成机制提供相关数据成果及一定的理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取右江民族医学院附属医院泌尿外科2020年5月—2020年12月期间因上尿路结石而行手术治疗或保守治疗的患者作为结石组，运用红外光谱分析法对获取的患者结石标本进行成分鉴定。根据结石成分类型，选取50例 CaOx 占结石组成分90%以上的患者纳入结石组，其中男性28例，女性22例，平均年龄(45.60±9.91)岁。另外随机收集50例在同一时期在本院进行体检的健康人群作为对照组，其中男性27例，女性23例，平均年龄(44.86±9.77)岁，两组年龄、性别比较差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 结石组纳入与排除标准 ①纳入标准：2020年5月～12月在本院泌尿外科住院并通过手术或保守治疗而获取结石标本的上尿路结石患者；具有完整的病历记录以及泌尿系CT、静脉泌尿系造影、彩超等影像学检查结果；符合《中国泌尿外科和男科疾病诊断治疗指南2019版》[8]中上尿路结石诊断标准；获取的结石标本中草酸钙含量>90%；同意作为研究对象参与本次研究者的患者。②排除标准：合并严重的泌尿系统感染、高尿酸血症、代谢综合征或患有先天性泌尿系统畸形；合并恶性肿瘤、动脉粥样硬化等心脑血管系统疾病、血液系统疾病以及其他重大疾病者；近期服用肾毒性药物以及合并严重肝肾功能不全者；不同意作为研究对象参与本次研究者。

1.3 实验仪器与试剂 结石红外光谱自动分析系统LIIR-20(天津蓝莫德科学仪器有限公司)、Epoch全波长酶标仪(美国 Biotek股份有限公司)、高速冷冻离心机 FRESCO 21(美国Thermo股份有限公司)、微孔板恒温孵育器MT70-2(中国米欧)、-80 ℃超低温冰箱(青岛海尔生物医疗股份有限公司)、压片机(天津蓝莫德科学仪器有限公司)、温控红外烤箱(天津蓝莫德科学仪器有限公司)、各规格移液器(德国 Eppendorf 股份有限公司)；钙卫蛋白ELISA试剂盒96Tests(武汉华美生物工程有限公司，批号：X20014971)。

1.4 实验方法

1.4.1 结石成分分析 收集重量约为1～5 g的结石标本，并进行洗涤、晾干、烘干、研磨、制片后，使用结石红外光谱自动分析系统LIIR-20对其进行结石成分分析。

1.4.2 测定结石组与对照组血清中S100A8/A9浓度 采集静脉血3～5 mL，离心后收集上层血清，按照S100A8/A9试剂盒说明书通过双抗体夹心酶联免疫吸附试验测定血清S100A8/A9浓度，测定时每个浓度样品设置2个复孔，取其平均值作为样本浓度。

2 结果

2.1 结石成分分析 根据结石成分分析结果，结石组共50例，其中一水草酸钙(calcium oxalate monohydrate，COM)13例，COM+二水草酸钙(calcium oxalate dihydrate，COD)28例，COM+COD+碳酸磷灰石(carbonate apatite，CA.AP)9例。根据结石成分将COM、COM+COD分为纯CaOx组，COM+COD+CA.AP分为含CaOx的混合结石组，其中纯CaOx组共41例，含CaOx的混合结石组共9例。3种结石成分分析图谱见图1～图3。

图1 COM结石红外光谱图

图2 COM+COD结石红外光谱图

图3 含CaOx的混合结石红外光谱图

2.2 血清S100A8/A9浓度的测定与比较 按照ELISA实验步骤进行操作，并使用波长设置在450 nm的全波长酶标仪检测出每个待测血清样品的OD值，按照标准品浓度与其对应OD值制作出标准曲线，并根据标准曲线计算样品中S100A8/A9浓度。结石组血清中S100A8/A9浓度显著高于对照组(P<0.01)；结石组中男性与女性血清中S100A8/A9浓度比较差异无统计学意义(P>0.05)；对照组中男性血清中S100A8/A9浓度与女性血清中S100A8/A9浓度比较差异无统计学意义(P>0.05)；结石组男性血清中S100A8/A9 浓度高于对照组男性血清中S100A8/A9 浓度(P<0.05)；结石组女性血清中S100A8/A9浓度高于对照组女性血清中S100A8/A9浓度(P<0.05)；纯CaOx组血清中S100A8/A9浓度高于对照组(P<0.05) ；含CaOx的混合结石组血清中S100A8/A9浓度显著高于对照组(P<0.05)；纯CaOx组血清中S100A8/A9浓度与含CaOx的混合结石组差异无统计学意义(P>0.05)。见表1～表3。

表1 结石组与对照组血清S100A8/A9浓度比较

表2 结石组内不同成分与对照组血清S100A8/A9浓度比较

表3 两组中男性与女性血清S100A8/A9浓度比较 单位：ng/mL

3 讨论

矿物质和有机化学成分是构成泌尿系结石的主要部分，其中草酸钙占据近80%，而结石基质蛋白是所有泌尿系结石的共有成分，虽然在结石中占比不多，但却是不可或缺的一部分。就目前各学者从结石患者的尿液、结石标本中分离并获取的一些结石大分子抑制物，例如：骨桥蛋白、基质Gla蛋白、Tamm-Horsefall蛋白等[9-11]。也有不少关于结石促进物的研究，S100A8蛋白作为SMP中的一种，这提示S100A8 有可能在结石形成、生长的过程中起促进作用[12]。BOONLA C等[13]从泌尿系结石患者的结石样品和尿液中鉴定出了各种蛋白质成分，并发现S100A8蛋白质在草酸钙结石患者的肾脏组织及尿液中均有表达，但在正常健康人的尿液中却未能检测到。而S100A8与S100A9通常以异源二聚体S100A8/A9蛋白复合物的形式存在[3-4]。就目前各项研究表明尿液、肾脏组织中的S100A8/A9与草酸钙结石的形成有着密切的联系，但血清中S100A8/A9是否参与了草酸钙结石的形成过程还尚未明确。目前国内外研究中有关血清中S100A8/A9表达水平与草酸钙结石之间的关系研究还较少。本研究通过酶联免疫吸附测定上尿路草酸钙结石患者与健康体检者血清中S100A8/A9浓度水平，发现上尿路草酸钙结石组患者血清中S100A8/A9蛋白质浓度水平明显高于健康对照组，说明血清高S100A8/A9水平可能更易患有CaOx结石。另外，由于男性与女性的泌尿系统结构以及激素水平之间存在较大差异，男性体内高水平的雄激素导致血清及尿液中的草酸浓度升高，并加快草酸通过尿液排出的速度，草酸浓度的不断升高加快CaOx 晶体的沉积速度，再综合多方面因素之间的相互作用从而导致男性与女性结石发病率不相同[14]。

研究还发现纯 CaOx组血清中S100A8/A9浓度高于健康人群对照组血清中S100A8/A9浓度；含 CaOx 的混合结石组血清中S100A8/A9浓度显著高于健康人群对照组血清中S100A8/A9浓度；而纯CaOx组血清中S100A8/A9浓度与含CaOx的混合结石组血清中S100A8/A9浓度，差异无统计学意义。根据ZHANG H等[15]研究显示含CaOx的混合性结石形成的原因可能是由于CA.AP的异质成核作用，后逐渐发展成为病理性结石，但是两者的血清S100A8/A9水平无明显差异，故血清S100A9/A9浓度水平还不能用于区别纯CaOx结石与含CaOx的混合性结石，结石红外光谱分析仍然是鉴别结石成分较为准确的技术手段。

关于S100A8/A9 蛋白质是通过何种作用机制参与泌尿系草酸钙结石的形成过程尚未能明确，推测S100A8/A9是通过以下几点来促进草酸钙结石的形成。首先，据研究发现，S100A8/A9 蛋白质之所以具有在含钙组织中调节钙离子的生物学功能，是因为其含有对Ca2+具有较强黏附、亲和作用的C-末端结合位点的结合域，而这个结合位点的作用大大的增强了草酸钙晶体的表面吸附能力，促使草酸钙晶体的黏附[16-17]。S100A8/A9通过与草酸钙晶体结合，增加晶体间的粘附力，使其更为牢固的吸附在肾小管上皮细胞上，从而形成结石核心。另外，聚集和黏附在肾小管上皮细胞的草酸钙晶体会引起细胞损伤，改变细胞膜正常结构，从而产生更多的晶体可附着点。肾小管上皮细胞表面吸附的草酸钙晶体还会诱发炎症反应，而炎症反应恰恰为结石形成的重要机制，晶体的聚集与吸附以及炎症反应的发生将直接或间接地促使结石形成。构建体外草酸钙晶体结石模型的研究[7]中也提示，草酸和草酸钙晶体均能引起肾小管上皮细胞产生炎性反应，使细胞损伤，并增加炎症细胞因子(如IL-6、IL-10、TNF-α)的表达，而S100A8/A9在特定条件下可刺激炎症细胞释放炎症介质及炎症蛋白直接参与炎症疾病发生过程，同时促炎物质如肿瘤坏死因子、白细胞介素等也可使S100A8/A9在巨噬细胞、内皮细胞等炎性细胞中过表达。

总之，血清S100A8/A9在上尿路草酸钙结石患者与健康人群之间确实存在表达差异，由此认为血清S100A8/A9高表达提示患有草酸钙结石可能性大。综上，本研究推测S100A8/A9 作为结石促进物，促进上尿路草酸结石形成，其可能是通过增加晶体的聚集与吸附以及改变炎性蛋白或炎性细胞因子的表达来促进草酸钙结石的形成，但具体调控机制仍需进一步研究。