河南省安阳市猪链球菌2 型分布及其药物敏感性

苏红辽，耿向华，韩红霞，吴红霞

（1.滑县农业综合行政执法大队，河南滑县 456400；2.滑县动物疫病预防控制中心，河南滑县 456400）

猪链球菌病是由多种不同血清群链球菌引起的，具有不同临诊症状传染病的总称，以淋巴结脓肿、脑膜炎、关节炎及败血症为主要临床特征。猪链球菌（Streptococcus suis，SS）是猪链球菌病的主要病原体，引起疾病谱多种多样，包括但不限于脑膜炎、败血症、肺炎、心内膜炎。通过荚膜抗原，SS 可分为35 个血清亚型，其中SS2 是最常从病猪体内分离到的一种亚型，致病力最强，各地检出率也最高[1]，而且可感染人并致死，引起的疾病为人兽共患病，因此其不仅给全球养猪业造成重大经济损失，而且威胁食品安全和人类健康[2]。

最早的人类SS 感染病例于1968 年报道，随后多个病例在欧洲、亚洲及北美被报道[3]。SS 可通过垂直传播和水平传播两种途径感染猪。SS 通常潜伏在规模养殖猪的扁桃体内，当携带病原仔猪的母源抗体逐渐消失时，可从扁桃体或其他黏膜表面向全身播散，继而发展为菌血症、败血症、心内膜炎、脑膜炎等[4]。具体而言，SS 致病的前提是细菌突破上皮细胞的多种屏障，进入血液，并在循环中大量增殖，随后随血流侵袭不同的器官，引起炎症反应，严重者可发生脓毒性休克而危及生命。SS 感染主要表现为急性发病，寒战、高热，可伴有呕吐、腹泻、头痛、肌肉关节疼痛等全身中毒性症状，病程发展迅速，可在1 d内累及中枢神经系统，出现休克、肝肾功能不全、凝血障碍[5]。另外，目前部分SS 菌株也出现了多重耐药性，若早期盲目使用不敏感抗生素，则会错过最佳治疗时机[6]。

本研究明确了河南省安阳市的SS2 地域性分布、生化特点及耐药情况，为有效防控猪链球菌病提供了有力支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 胰蛋白胨大豆酵母浸膏肉汤（TSB）和胰蛋白胨大豆酵母浸膏琼脂（TSA），为青岛高科技工业园海博生物技术有限公司产品，按说明书配制、灭菌后，分别按体积分数5%、10%，每升加入50 mL 小牛血清。2×TaqMix、DL 2 000 DNA Marker，为翌圣生物科技（上海）股份有限公司产品；胎牛血清，为浙江天杭生物科技股份有限公司产品。

1.1.2 标准菌株 SS2 标准菌株，购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCC 号为3930，原始编号为ATCC 700796）。

1.1.3 药敏纸片 庆大霉素、卡那霉素、四环素、阿奇霉素、阿莫西林、氨苄西林、头孢呋辛、头孢曲松等16 种抗菌药物药敏纸片，购自杭州滨和微生物试剂有限公司及Oxoid 公司。

1.1.4 主要仪器 PCR 仪，Applied Biosystems 公司产品；凝胶成像系统，上海金鹏分析仪器有限公司产品；二级生物安全柜，苏州安泰空气技术有限公司产品；隔水恒温培养箱，上海舍岩仪器有限公司产品。

1.2 方法

SS2 菌株PCR 检测以及生化特性、药敏性检测等操作，均在生物安全二级实验室进行，并严格执行生物安全措施。

1.2.1 受试菌株分离 受试菌株由滑县动物疫病预防控制中心在无菌条件下分离，参考刘丽蓉等[7]的方法进行，样品采自安阳县、北关区、文峰区、林州市、殷都区、龙安区、汤阴县、内黄县和滑县疑似SS 感染病猪，样本为猪关节液、肺组织和脑组织。

1.2.2 链球菌PCR 鉴定 采用裂解法提取细菌DNA：挑取单菌落接种到含有5%（体积分数）血清的TSB 中，培养24 h；取1 mL 菌液加入1.5 mL 离心管中，10 000 r/min 离心5 min，弃上清液；加入100 μL 灭菌ddH2O，置沸水中煮沸10 min，冰浴10 min，10 000 r/min 离心10 min，取上清液，即为DNA 模板。使用Applied Biosystems 公司的PCR 仪，分别加入设计好的SS 和SS2 引物，以DNA 为模板分别进行扩增。参考菌株基因号为CP100432，SS 鉴定引物（F：TTCCAATCGGCGGTGGTAAA；R：TCGCACATGGAAGGGCAATA）扩增长度为566 bp，SS2 鉴定引物（F：AGTGATTTGTCGGGAGGGTT；R：ATGCCACTGTAGCGTCTCTT）扩增长度为498 bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR 体系：2×TaqMix 12.5 μL，双蒸水9.5 μL，上下游引物各1.0 μL，模板2.0 μL；反应程序：95 ℃预变性2 min；95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 60 s，35次循环；72 ℃延伸10 min。PCR 扩增，参照赵朴等[8]的方法进行，取出产物后使用1%琼脂糖进行凝胶电泳检测。

1.2.3 SS2 生化试验鉴定 SS2 生化试验鉴定参考刘丽蓉等[7]的方法进行。

1.2.4 SS2 药敏试验 将分离纯化的SS2 菌株按常规方法[9]进行药敏试验。

2 结果

2.1 细菌培养特性

在含有10%（体积分数）胎牛血清的TSA 平板上，分离菌株长出大量半透明、针尖大小、光滑、湿润的小菌落，革兰氏染色阳性，成对或呈短链状排列，符合SS 菌落形态及特点。

2.2 SS 分离株PCR 鉴定

从56 份病猪样品（包括关节液、肺组织和脑组织）中，共分离鉴定出来自于全市9 个县区的38 株SS 菌株（图1），其中21 株为SS2 菌株（图2），占55.3%，从安阳县、汤阴县、滑县、文峰区、北关区、殷都区、龙安区7 个县区采集样品中分离到（表1）。在17 份关节液标本中，分离出11 株SS 菌株，其中6 株为SS2 菌株；21 份脑标本中，分离出16 株SS 菌株，其中10 株为SS2 菌株；在18 份肺标本中，分离出11 株SS 菌株，其中5 株为SS2 菌株。

表1 SS 分离株来源情况

2.3 生化鉴定

为进一步确认SS2 分离菌株的生化特性，挑选经PCR 鉴定为SS2 的菌株进行糖发酵、V-P 等生化试验。结果（表2）显示，棉子糖、乳糖、七叶苷发酵试验为阳性，甘露糖、阿拉伯糖、山梨糖、菊糖、松三糖、甘露醇、D-核糖、甘油发酵试验及V-P 试验均为阴性，在高盐肉汤（6.5%）和肉汤（pH9.6）中均不能生长，全部符合SS2 的生化特点。

表2 分离菌株的生化鉴定结果

2.4 药敏试验

为分析SS2 对常用抗菌药物的敏感性，使用16 种抗菌药物药敏纸片检测SS2 分离菌株的药敏情况。结果（表3）显示：全部21 株SS2 菌株对氨苄西林和头孢曲松敏感，20 株对头孢呋辛敏感，19 株对阿莫西林和头孢噻肟敏感；而全部21 株SS2 菌株对卡那霉素、阿米卡星和磺胺异恶唑耐药，20 株对庆大霉素和四环素耐药，19 株对阿米卡星耐药。

表3 21 株SS2 分离菌株对16 种抗菌药物的药敏试验结果

3 讨论

SS 是导致猪链球菌病最主要的病原，能通过黏膜或伤口等传播途径感染人，从而对人类生命健康构成致命威胁。近年来，SS 主要引起两种人类疾病，即败血症合并感染性休克和脑膜炎，而且此类疾病的发病率也越来越高。因此，按照国家“人病兽防、关口前移”的总要求，了解SS 的地域性亚型分布以及生化特征和药物敏感性对防治SS 人畜感染，减少畜牧业损失和促进人类健康都具有重要意义。

SS 的血清型可分为35 种，不同亚型对人和猪的致病力也强弱不一[4]。目前有6 种血清亚型被重新分类，其中32 和34 亚型归类为Streptococcus orisratti，20、22 和26 亚型归类为Streptococcus parasuis，33 亚型归类为Streptococcus ruminantium[10]。SS2 亚型致病力极强，可由病猪传染给人，引起人急性脓毒性休克，预后极差，因此需在诊疗过程中明确感染的SS 类型，以便早发现、早治疗。PCR 技术的发展及全基因组测序的应用使人们能够进一步鉴别和明确SS 的亚型类别[11]。本研究从56 份病猪样品分离出38 株SS，在关节液、脑组织和肺组织中均有检出，其中21 株被进一步鉴定为SS2 亚型，占全部SS 分离菌株的55.3%，分布在安阳县、滑县、汤阴县、文峰区、北关区、殷都区、龙安区7 个县区。这提示SS2 是安阳市SS 优势流行亚型，且流行范围较广。

生化试验显示，糖发酵试验阳性者细菌生长良好，能发酵糖产酸；阴性者不生长，不发酵糖也不产酸。SS 对糖发酵的阳性反应普遍包括葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖和胆汁七叶苷等，部分菌株阳性反应还包括棉子糖、甘露醇等。糖发酵生化试验结果提示，棉子糖、乳糖、七叶苷发酵试验为阳性，说明SS2 可正常生长，这均符合SS2 的生化特点。

考虑到SS2 的高致病性，进一步研究了SS2分离菌株对16 种抗菌药物的敏感性，结果全部21株SS2 菌株对卡那霉素、阿米卡星和磺胺异恶唑耐药，20 株对庆大霉素和四环素耐药，19 株对阿米卡星耐药，表明SS2 分离菌株存在多重耐药性。因此，临床治疗时，需考虑细菌的耐药情况，最好通过药敏试验筛选敏感抗菌药物，避免盲目用药，贻误病情。另外，应制定合适的抗菌药物组合，避免使用耐药药物，对高敏的抗菌药物应合理搭配，以保障治疗的有效性。最后，在预防和治疗链球菌病过程中，同一种抗菌药物使用时间不宜过长，应辅以组合用药，避免耐药性加重。

本研究了解了河南安阳市猪群中的SS2 地域性分布及其药物敏感性，对该地区猪链球菌病防控具有借鉴意义。