2021 年云南省边境地区牛口蹄疫血清学调查

寇美玲，谢佳芮，廖德芳，宋建领，苗海生

（云南省畜牧兽医科学院，云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，云南昆明 650224）

口蹄疫（foot and mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒（foot and mouth disease virus，FMDV）引起的，主要感染猪、牛、羊和其他偶蹄类动物的急性、热性、高度接触性传染病[1-2]。该病分布广，传播速度快，传播途径多，流行周期长，不易防控和根除，因而被世界动物卫生组织（WOAH）列为须通报动物疫病，被我国列为一类动物疫病[3-4]。FMD 曾在世界范围内多次暴发流行，在新流行地区，引起的牛发病率可达90%～100%，对成年牛的致死率为3%～5%，而对犊牛的致死率高达70%～80%[5]，也可导致感染动物生产性能下降，种用价值丧失，给畜牧业带来巨大经济损失[6]。近年来我国FMD 防控取得了较大进展，但零星疫情依然存在[7]。FMDV 共7 个血清型，其中在亚洲主要流行O、A 和亚洲I 型[3]，在我国近年来主要是O、A 型。疫苗免疫是预防和控制 FMD的主要方式。我国目前对 FMD 实行强制免疫策略，采取“先打后补”的补助方式。FMDV 抗体水平是评价疫苗免疫效果的主要方式。为掌握云南省边境地区FMDV 的疫苗免疫效果和感染情况，2021年在边境地区7个县（市）采集牛血清样品1 522份，采用cELISA 方法进行FMDV O 型、A 型和非结构蛋白抗体检测，评价疫苗免疫效果及带毒风险，从而为该病防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 血清样品

2021 年采集云南省边境地区景洪市、芒市、孟连县、勐海县、勐腊县、沧源县和盈江县等7 个县（市）的1 522 份牛血清样品。每个县（市）按采样点所属地理位置划定区域，将区域内养殖场、隔离场和散养户编号，随机抽取养殖场1～3 个、隔离场1 个、散养户3～19 个，场群内按牛耳标号随机采样。样品采集由7 个县（市）动物疫病预防控制中心实施。具体采样信息见表1。

表1 云南省边境地区7 个县（市）采样信息统计

1.2 主要试剂

O、A 型FMDV 标准阴、阳性血清，O、A 型FMDV cELISA 抗体检测试剂盒，参照Mackay 等[8]、Paiba 等[9]方法，由云南省畜牧兽医科学院国家口蹄疫专业实验室（昆明）制备[101]；试剂盒涉及的FMDV A、O 型灭活抗原，由中普生物有限公司（保山）提供；FMDV 非结构蛋白单抗阻断ELISA 试剂盒，购自深圳真瑞生物技术有限公司。

1.3 检测方法

1.3.1 血清抗体检测 利用O、A 型 FMDV cELISA 抗体检测试剂盒，对样品进行血清学检测，两种血清型操作方法相同。取出试剂盒提供的ELISA 板，加入10 μL 待检血清以及阳性、阴性对照血清至相应检测孔和对照孔，每孔加入50 μL 100倍稀释的竞争抗体，震荡混匀，37 ℃温育1 h；PBST 洗板3 次，吸水纸上拍干；每孔加入50 μL 1 000 倍稀释的兔抗豚鼠HPR 酶标二抗，37 ℃温育40 min；洗板5～6 次拍干；加入TMB 显色液100 μL/孔，37 ℃避光温育10 min；加入终止液100 μL/孔，ELISA 读板仪450 nm 波长测定样本和对照的吸光值A450。试剂盒质控标准：阳性对照孔平均A450值≥0.8，阴性对照孔平均A450值≤0.3 时，试验结果成立；抑制率≥40%时判定为阳性，＜40%时判定为阴性。

1.3.2 非结构蛋白抗体检测 利用FMDV 非结构蛋白单抗阻断ELISA 试剂盒，按照试剂盒说明书操作。结果判定：阻断率=（阴性对照A450平均值-样品孔A450平均值）/阴性对照A450平均值×100%。当阳性对照A450平均值≥55%，且阴性对照A450平均值-阳性对照A450平均值≥0.6 时，试验结果成立；被检样品阻断率≥40%判定为阳性，25%～40%判定为可疑，＜25%判定为阴性。

1.4 数据分析

比较FMDV O 型、A 型及非结构蛋白抗体阳性率，采用SPSS 22.0 软件进行统计学分析。

2 结果与分析

2.1 地区分布

地区统计结果（表2）显示：2021 年云南省7 个边境县（市）1 522 头份牛血清样品FMDV O 型抗体阳性率为40.10%～85.50%，A 型为58.50%～84.50%，非结构蛋白抗体为25.76%～57.50%，O 型（57.61%）、A 型（67.29%）平均抗体阳性率均未达到国家最低要求（≥70%）。各县（市）抗体阳性率有所差异，其中勐腊县最高（O型85.50%、A 型84.50%、非结构蛋白57.50%），不同地区间O 型、A 型及非结构蛋白抗体阳性率均差异显著（P＜0.05）。勐腊、盈江牛非结构蛋白抗体阳性率分别达57.50%、54.62%，说明这些地区存在FMD 流行的可能性较大。

表2 云南省边境不同地区牛FMDV 抗体检测结果统计

2.2 群间分布

2.2.1 不同来源 不同来源牛统计结果（表3）显示：1 522 份牛血清样品中包含入境牛样品340份、本地牛1 182 份；本地牛O、A 型抗体阳性率分别为54.31%、63.87%，非结构蛋白抗体阳性率为40.52%，入境牛O、A 型抗体阳性率分别为70.29%、79.70%，非结构蛋白抗体阳性率为58.23%。入境牛O 型、A 型、非结构蛋白抗体阳性率均明显高于本地牛（P＜0.05），说明入境牛免疫抗体水平较低，带毒风险较大。

表3 不同来源牛FMDV 抗体检测结果统计

2.2.2 不同饲养方式 不同饲养管理方式牛的FMDV 抗体检测统计结果（表4）显示：规模场牛O、A 型FMDV 抗体阳性率总体高于散养户，非结构蛋白抗体略低于散养户，说明规模化养殖场疫苗免疫状况好于散养户，带毒风险低于散养户；而隔离场均为外来牛，3 项检测指标均明显高于国内规模场和散养户（P＜0.05）。

表4 不同饲养管理方式牛的FMDV 抗体检测结果统计

3 讨论

云南省地处我国西南边境，边境线漫长且犬牙交错，边民往来频繁，活牛走私入境活动难以控制[11-12]。2020 年以来，受新冠肺炎疫情影响，边境管控加强，入境牛数量虽大幅减少，但依然存在。东南亚地区是FMDV 疫源地。据WOAH 官方网站公布的信息统计，2020 年1 月—2021 年6 月东南亚地区共发生500 余起FMD 疫情，这对我国FMD 防控形成较大威胁。云南省边境地区作为阻断东南亚 FMD 疫情传入我国的第一道屏障，疫苗免疫强度和效果尤为重要。本次调查对同1 份样品分别进行O、A 型FMDV 抗体检测和非结构蛋白抗体检测，前者是为了评价免疫效果，后者是为了判断感染情况，检测结果具备一定的科学性和全面性。

血清样品采集自云南省边境地区7 个县（市）。这些地区牛养殖相对集中，并且是外来牛入境重要通道，因此所采样品具有一定代表性。O、A 型FMDV 抗体检测结果显示，云南省边境地区抗体水平偏低，除勐腊县外，其他县（市）均未达到70%的国家最低免疫要求，亟需提升疫苗免疫强度。非结构蛋白抗体检测结果显示，云南省边境地区牛非结构蛋白抗体阳性率整体偏高（25.76%～57.50%），说明边境地区存在一定的FMDV 流行风险，但也可能与接种的疫苗未经纯化以及该检测方法本身的缺陷有一定关系。勐腊和盈江县的非结构蛋白抗体阳性率分别达到57.5%和54.62%，经查证这两个地区的牛多数为走私入境牛。不同饲养方式牛的统计结果表明，隔离场中边境缉私部门查获的走私入境牛O、A 型抗体和非结构蛋白抗体阳性率均高于本地牛。考虑到缅甸、老挝等东南亚国家FMD 疫情现况和免疫情况，推断这部分牛可能感染过或携带有FMDV。同时还发现，规模场疫苗免疫状况好于散养户，非结构蛋白抗体阳性率低于散养户，表明规模场抵御FMDV感染的能力要强于散养户。

4 结论

云南省边境地区牛FMD 免疫保护水平不高，且存在一定的病毒传入风险，亟需进一步提高疫苗免疫接种强度和免疫效果评估力度，持续对云南省边境地区开展牛FMD 病原学和血清学监测，掌握其流行病学特点和规律，以便及时发现和预警FMD 疫情，为边境地区FMD 防控提供数据支撑。