肺泡灌洗液宏基因二代测序在不明病原体肺部感染中的诊断价值

夏勇惠，高秀峰，王 慧，黄友明

(皖南医学院第二附属医院 呼吸与危重症医学科,安徽 芜湖 241000)

肺部感染是呼吸与危重症医学科常见的疾病之一，当肺部感染性疾病的病原体诊断不明确时，临床医生往往根据经验选用抗生素，不能使用针对性的抗菌药物进行治疗，若抗菌药物未能覆盖病原体及治疗疗程不足会导致患者病情加重，甚至死亡[1]。在不明确病原体时，临床医生经验性抗生素治疗同时标本送检微生物培养,但常规微生物培养阳性率低,往往不能明确，这将导致抗菌药物多用、滥用，甚至诱导细菌耐药，所以肺部感染性疾病诊疗的决定因素是找到致病病原体[2]。宏基因二代测序(metagenomic next-generation sequencing，mNGS)是一种测定病原体的核酸序列，然后与已知病原体核酸基因库进行对比，从而明确病原体的检测方法。mNGS检测高效迅速，并可广泛覆盖已知病原体，尤其对重症、免疫缺陷患者感染的少见病原体、机会性感染病原体的检出有重要意义[3-4]。本文回顾性分析皖南医学院第二附属医院收治30例不明病原体肺部感染患者，研究肺泡灌洗液mNGS对不明病原体肺部感染的诊断和治疗价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 回顾我院呼吸与危重症医学科2020年8月～2021年8月收治的30名不明病原体肺部感染患者，男18例，女12例，年龄27～86(59.2±16.1)岁。纳入标准：①肺部感染诊断标准符合中国成人社区获得性肺炎诊断和治疗指南2016版[5]；②年龄>18岁；③均行传统病原体检测(痰涂片、痰培养、肺泡灌洗液培养)及肺泡灌洗液mNGS检测；④均自愿行支气管镜检查、mNGS检测并签署知情同意书。排除标准：①严重心脏疾病(严重心功能不全、急性心肌梗死、恶性心律失常)；②急性脑出血或脑梗塞；③严重血液病有出血倾向，血小板计数<20×109/L；④活动性大咯血；⑤女性妊娠期；⑥患者不能配合。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 痰标本采集：晨起后用生理盐水漱口2次，再用力咳出深部痰，无菌痰杯收集深部痰1～2 mL。立即送检，行痰涂片、痰培养。肺泡灌洗液标本采集：选择肺部影像上新病变或进展性病变的肺段；在目标肺段由操作孔注入2%利多卡因1～2 mL局部麻醉后，经操作孔分次注射生理盐水(每次20～30 mL)，总量80～100 mL,回收率≥30%，回收的灌洗液分别用无菌管收集。取肺泡灌洗液20 mL行涂片、培养，取肺泡灌洗液10mL行mNGS检测。立即送检，若延迟送检，将标本保存于4℃冰箱。

1.2.2 肺泡灌洗液mNGS检测及分析 所采集肺泡灌洗液10 mL，冷藏保存，均送检至杭州杰毅医学检验实验室行定量宏基因组检测。

2 结果

2.1 传统检测与肺泡灌洗液mNGS检测阳性率的比较 传统病原体检测(痰涂片、痰培养、肺泡灌洗液培养)阳性患者6例(阳性率20.0%)，肺泡灌洗液mNGS检测阳性患者25例(阳性率83.3%)。肺泡灌洗液mNGS检测阳性率高于传统病原体检测，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 肺泡灌洗液mNGS检测与传统检测阳性率的比较

2.2 肺泡灌洗液mNGS检测与传统检测病原体分布 25例肺泡灌洗液mNGS检测阳性患者病原体分布：单一病原体7例(肺炎克雷伯氏菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌、鲍曼不动杆菌、鹦鹉热衣原体、耶氏肺孢子菌、烟曲霉各1例)；链球菌2例(中间链球菌、缓症链球菌各1例)；人疱疹病毒2例；分枝杆菌12例(结核分枝杆菌复合群7例，龟分枝杆菌4例，鸟型分枝杆菌复合群1例)；混合感染2例(非典型韦荣氏球菌、空肠普雷沃菌、溶齿放线菌、葛氏放线菌、副血链球菌混合1例，嗜麦芽窄食单胞菌、纹带棒状杆菌、洋葱伯克霍尔德氏菌、鲍曼不动杆菌混合1例)。6例传统检测组阳性患者病原体分布：缓症链球菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌各1例，结核分枝杆菌2例(痰涂片抗酸染色阳性)。肺泡灌洗液mNGS对分枝杆菌、真菌及机会感染病原体的检出高于传统病原体检测。

2.3 肺泡灌洗液mNGS检测结果指导用药和经验性治疗疗效比较 肺泡灌洗液mNGS检测病原体针对性药物治疗疗效(88.0%)优于经验性药物治疗(40.0%),差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 肺泡灌洗液mNGS检测结果指导用药后疗效比较

3 讨论

肺部感染是呼吸与危重症医学科的常见病，若感染不能有效控制，病情可进一步进展为重症感染而危及生命。国外研究报道[6-7]，成人及儿童肺部感染在全球常见疾病中患病率及病死率居第2位，疾病所致负担仅低于缺血性心脏病。而肺部感染治疗的关键在于明确病原体，给予针对性的抗感染治疗。肺部感染病原体相对复杂，有细菌、病毒、真菌及特殊病原体等。特别是使用糖皮质激素、免疫抑制剂，恶性肿瘤，器官移植术后及免疫功能低下的患者容易出现各种少见病原体感染、混合感染及机会感染[8-9]，使诊断及治疗难度增加。目前临床上明确病原体方法主要为传统微生物培养，其阳性结果虽有明确诊断意义，但是存在阳性率低、培养周期长、诊断准确率有限等缺点[10]。

2014年使用mNGS技术查找病原体被首次报道[11]，并起到决定性作用。近年来，mNGS技术已越来越多地应用于肺部感染疾病病原体的诊断。mNGS技术与传统微生物培养相比具有高通量、广覆盖、快速鉴定、高度灵敏等优点。传统微生物培养阴性患者，特别是危急重症、合并免疫抑制、疑难罕见病患者行mNGS检测有重要的诊断价值[12]。本研究共纳入30例患者，传统病原体检测阳性患者6例，阳性率20.0%。肺泡灌洗液mNGS检测阳性患者25例，阳性率83.3%。肺泡灌洗液mNGS检测阳性率高于传统病原体检测。本研究发现鹦鹉热衣原体1例；耶氏肺孢子菌1例；烟曲霉1例；人疱疹病毒2例；分枝杆菌12例；混合感染2例。说明mNGS技术在分枝杆菌、真菌及机会感染病原体明确诊断上有一定优势。

有研究报道mNGS技术对重症肺部感染患者抗感染药物使用有指导意义，并可使患者临床获益[13]。本研究发现：肺泡灌洗液mNGS阳性患者25例，均根据肺泡灌洗液mNGS检测病原体选用针对性药物治疗，治疗后肺部影像学病灶吸收及感染指标恢复正常患者22例，好转率88.0%，所以根据肺泡灌洗液mNGS检测病原体选用针对性药物治疗，疗效明显优于经验性药物治疗。

本研究发现30例肺部感染患者肺泡灌洗液mNGS检测阳性患者25例，阴性患者5例，阴性率16.7%。说明尽管mNGS技术在明确病原体检测上具有明显优势，但同时也有一定局限性。mNGS技术检测微生物需与数据库病原微生物基因组序列比对[14]。虽然目前数据库已有大量病原微生物基因序列，但尚需进一步完善。mNGS有破壁缺陷，在处理胞内菌及厚壁病原体肺泡灌洗液标本时，可出现序列数减少及假阴性。mNGS尚不能有效区分检测到的病原体是污染菌、定植菌，还是致病菌，且病原微生物序列数、相对丰度与致病性尚无关联性标准。mNGS检测结果的判读尚有人源背景影响，需要完善新数据分析系统以解决上述问题[15]。不同的生物检测公司数据库、仪器设备、标本处理均不尽相同，都可能使检测结果产生误差。所以mNGS技术现在尚不能完全取代传统病原体培养方法。

总而言之，肺泡灌洗液mNGS检测与传统检测相比有助于提高肺部感染的病原体检出率，特别是分枝杆菌、真菌及机会感染病原体的检出，从而指导抗微生物药物的精准治疗，提升治疗效果。肺泡灌洗液mNGS检测在肺部感染中有非常高的临床应用价值。但mNGS技术在临床应用中尚有不足，需进一步研究完善。