沼泽红假单胞菌的培养优化及植物病害防治研究

颜 纲，邹 宁，高乐天

鲁东大学，山东烟台 264000

沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustris），红螺菌科，红假单胞菌属，属于光合细菌中紫色非硫细菌属的代表菌种之一，也是目前应用较广泛的光合细菌之一。

王兰等[1]利用沼泽红假单胞菌和纤细红螺菌、球形红假单胞菌的混合菌液处理虾池养殖废水，4 d后发现混合菌体对养殖废水中的COD、氨氮的去除率分别达到了72.59%、89.2%。崔艺久等[2]对沼泽红假单胞菌的培养基和培养条件进行了优化以获得类胡萝卜素，在培养7d后，类胡萝卜素最大产量达2.863 mg/g。杨素萍等[3]探究了沼泽红假单胞茜Z菌株光合产氢的主要影响因素，研究结果表明：在标准状况下，菌株的最大产氨速率可达19.4 mL/（L·h）。

易力等[4]从洛河水域分离筛选得到2株光合细菌，分别为沼泽红假单胞菌、万尼氏红微菌，这2种菌对模式菌株金黄色葡萄球菌和大肠杆菌都具有较好的抑制作用，且沼泽红假单胞菌对大肠杆菌的抑制效果优于万尼氏红微菌，后者对金黄色葡萄球菌的抑制效果优于前者。吴希阳等[5]研究发现，沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustris，PSB06）对稻瘟病具有良好的防治效果。进一步分离抑菌活性物质，利用蛋白层析分离技术分离得到一个Atp2蛋白。后期试验证明：Atp2蛋白能干扰稻瘟病病原菌附着胞的形成，从而降低其在水稻寄主上的致病力和侵染力[6-10]。

为了进行大规模、低成本、高产量的生产，对细菌的培养基配方、培养条件等进行探究优化实验。而在培养过程中实际应用时发现，沼泽红假单胞菌对冬枣病害具有一定的治疗效果，因此，设计其对不同果树、不同病害的防治实验，以期获得对某些植物病害防治效果佳，对环境、人都安全且无毒害的生物防治手段。

1 沼泽红假单胞菌的培养优化

实验用到的沼泽红假单胞菌菌种和原始培养配方由实验室提供。考虑光合细菌生长需要光，反应容器采用透光性较好的塑料桶（10 L）。实验用到的药品原料为市场上容易购买的药品，这也是为了尽可能贴近实际生产，为大规模培养提供研究基础。由于是室内自然条件下培养沼泽红假单胞菌，环境中的温度、光照强度等因素只能作为实验过程中的参数进行记录，不能作为培养条件的优化因素。

1.1 实验材料

1.1.1 菌种 沼泽红假单胞菌，由鲁东大学藻类工程中心提供。

1.1.2 试剂及仪器 试剂：结晶乙酸钠、无水氯化钙、硫酸镁、葡萄糖、硫代硫酸钠、次氯酸， 酵母膏、尿素、复合肥1（N-P2O5-K2O)、复合肥2、磷酸二氢铵、硝酸铵。仪器：紫外分光光度计、照度计、烧杯、搅拌棒、10 L塑料桶。

1.2 实验方法

（1）C源优化实验：对培养基中的C源(结晶乙酸钠)进行浓度优化，设置其浓度梯度为3、5、10、20、50、100 g/L的实验组；（2）N源优化实验：对培养基中的N源进行种类优化，可供选择的N源有：尿素、复合肥（N-P2O5-K2O）、硝酸铵、硝酸钠和磷酸二氢铵；（3）P源优化实验：对培养基中的P源进行种类优化，可供选择的P源有；磷酸二氢钾、磷酸二氢铵和复合肥。将10 L塑料桶中装入9 L用次氯酸钠消毒法进行消毒自来水，加入按照上述培养基方法分别配置的培养基后，以10%的接种量接种沼泽红假单胞菌菌种，接种后对培养液进行振荡混匀，立即测量相关参数，主要包括OD560、温度（水温）、光照强度、pH值等。以此作为初始数据，之后每天定时进行振荡摇匀操作和测量实验数据。

上述实验完成后发现能使细菌生长较好的N、P源有：磷酸二氢钾、复 合 肥1（N:P:K=28:6:6）和 复 合 肥2（N:P:K=15:15:15）。对上述N、P源进行浓度优化，以不添加任何N、P的配方为对照组，设置复合肥1组、磷酸二氢钾组、复合肥2组，分别设置浓度梯度为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g/L，每个梯度设置3个重复。重复以上培养过程。

1.3 结果与分析

（1）C源优化实验。由图1可知，在自然条件下，乙酸钠的添加量对沼泽红假单胞菌的生长有影响，其中5、10、20 g/L的浓度较好，添加量为10 g/L时，有最大增长量。单因素分析发现，P=0.000＜0.01，具有极显著性。因此，可确定C源（乙酸钠）最佳添加浓度为10 g/L。

图1 浓度优化实验细菌的生长曲线

（2）N、P源种类优化实验。由图2可知：复合肥组、NH4H2PO4组和KH2PO4组等N、P源都可以促进沼泽红假单胞菌生长。总体来看，复合肥组的促进效果最 佳，NH4H2PO4次之，NH4H2PO4效果较弱。最终确定P源为复合肥和磷酸二氢钾。

图2 氮、磷源种类优化实验细菌生长曲线

（3）N、P浓度优化实验。由图3可知，在自然培养条件下，添加复合肥2（N:P:K=15:15:15）可以明显促进细菌生长，最终OD560值可以达到1.322。但复合肥浓度达到一定程度后时对菌体生长的促进能力下降。经单因素分析，P=0.000＜0.01，即具有极显著性，结合生长曲线，最终确定复合肥2的添加浓度为0.5 g/L。

图3 复合肥2组浓度优化实验细菌生长曲线

1.4 小结

实验得知，N、P、C等基础元素对光合细菌的生长有较大影响，C源乙酸钠添加浓度在5、10、20 g/L都可较好地促进沼泽红假单胞菌的生长。基于生产成本的考虑，确定最佳添加浓度为10 g/L。N源种类优化实验结果表明：沼泽红假单胞菌可以代谢硝态氮、铵态氮、复合型氮等多种氮源，其中，复合型的N源促进细菌生长的能力更强。在P源种类探究实验中，复合肥和磷酸二氢铵的添加都可以显著促进细菌生长，其中复合肥在实验后期促进效果更好，但前期NH4H2PO4组的促进更明显、快速。经过浓度优化实验进一步确定最佳N、P源为复合肥（N：P：K=15：15：15），其对细菌生长都具有较好的促进效果，最佳添加浓度为0.5 g/L。

2 沼泽红假单胞菌在植物病害防治方面的应用

2.1 实验材料

2.1.1 菌种 沼泽红假单胞菌，由鲁东大学藻类研究中心提供。由从温室大棚获取枣锈病、枣炭疽病、白粉病、根腐病、叶霉病、晚疫病等病害植物部位后分别分离筛选得到病原菌。

2.1.2 试剂及仪器 试剂：结晶乙酸钠、无水氯化钙、硫酸镁、酵母膏、抑菌试纸片（φ=1 mm）。仪器：超净工作台、细菌培养箱、移液枪、试管、培养皿、镊子、接种针、涂布棒、酒精灯。

2.2 实验方法

从植物患病部位取得带有病害的组织，从中分离、筛选得到相关病害的病原菌株，将病原菌纯化后，与培养一段时间的沼泽红假单胞菌进行抑菌实验，利用浸泡过不同处理方式菌液的抑菌试纸片在培养皿上进行抑菌实验，通过其抑菌圈大小得到沼泽红假单胞菌对相关病害病原菌的抑菌效果。

2.2.1 病原菌的分离、筛选、纯化 患病的植物组织、器官进行研磨或用无菌水进行冲洗、浸泡得到菌悬原液，过滤得到菌悬液。将菌悬液稀释后涂布到PDA培养基，培养一段时间后镜检。得到菌落后进行纯化培养，采用划线法将分离得到的菌落接种到平板上，确定其生长周期情况，确定合适的观察时间。

2.2.2 制备光合细菌处理液 将沼泽红假单胞菌发酵培养一段时间后，再分别将其进行相应处理，制成为经高温灭菌后的菌液、离心后上清液、离心后的菌体经无菌水重悬的菌体、菌原液、无菌水等5种处理的菌液。将抑菌试纸片浸泡在上述5种处理液中半小时待用。

2.2.3 抑菌试验 将纯化后的病原菌接种到定点位置，将浸泡后的抑菌试纸片放置在接种了病害菌株培养基的特定标记区域中，培养一段时间后，镜检观察是否具有抑菌圈并对抑菌圈大小进行测量、分析。

2.3 结果与分析

由表1可知，在植物病害防治实验中，沼泽红假单胞菌对枣锈病白粉病、叶霉病、褐腐病等病害的病原菌都具有极显著的抑菌效果，对枣炭疽病具有显著的抑制效果、对根腐病具有一定的抑菌效果。其中，发酵原液对枣炭疽病病原菌的抑制效果更好，上清液对枣锈病病原菌的抑制效果优于发酵原液经离心后，重悬菌体的菌液对枣炭疽病、枣锈病、白粉病的病原菌都具有较好的抑制效果，灭火后的菌液对枣锈病病原菌仍具有较好抑制效果，多种处理菌液对根腐病病原菌有一定的抑制效果。

表1 PSB对7种植物病害的抑菌率 %

3 结论

实验得知，N、P、C等基础元素对光合细菌的生长有较大影响。最佳C源乙酸钠添加浓度为5、10、20 g/L；N源优化实验中，复合肥2（N:P:K=15:15:15）促进细菌生长的效果最好，最佳添加浓度为0.5 g/L；P源优化实验中，NH4H2PO4组的促进速率最快，复合肥2（N:P:K=15:15:15）的最终浓度最高，最佳添加浓度为0.5 g/L。综合考虑促进效果及生产成本，确定最终培养基配方是将乙酸钠浓度改为10 g/L，额外添加复 合 肥2（N:P:K=15:15:15）0.5 g/L。培养条件中，温度在25℃以上、pH值为7.5～8.0时细胞生长更快。

在植物病害防治实验中，实验结果显示：沼泽红假单胞菌发酵液对枣锈病、白粉病、叶霉病、褐腐病、晚疫病、枣炭疽病等病害的病原菌都具有较好的抑制效果，对根腐病不具有抑制效果。实验中还发现不同处理方式的发酵液对不同病害病原菌的抑制效果不同。其中发酵液、离心后的上清液、离心后的菌体重悬液、灭活的发酵液都对枣锈病病原菌、褐腐病病原菌、叶霉病病原菌具有显著的抑制效果。发酵液、离心后的上清液、离心后的菌体重悬液对枣炭疽病病原菌、白粉病病原菌以及晚疫病病原菌具有较好的抑制效果。