MTHFR基因单核苷酸多态性与冠心病相关性研究

赵唱 贺欣

冠心病(coronary atherosclerotic heart disease)是临床上心血管内科最常见的疾病之一，发病率较高，由于其发病机制复杂，发病机制目前尚未完全阐明，大量研究发现冠心病发病受外界条件和遗传基因两大因素的共同影响，随着基因测序等分子诊断技术的迅速发展，使得对冠心病个体化诊断和治疗成为可能[1]。目前，其病因除了已探明的血脂异常、高血压、吸烟和糖尿病等传统的危险因素，冠心病易感基因等分子水平的危险因素研究也逐渐深入[1]。人体中叶酸代谢途径的关键酶之一为亚甲基四氢叶酸还原酶(methylene tetrahydrofolate reductase，MTHFR)。研究显示，编码此酶的MTHFR 基因突变可增加冠心病的发病风险，MTHFR基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)与冠心病发病相关。目前，MTHFR基因常见的10个SNP位点有rs1801131、rs1801133、rs4846048、rs3737966、rs1537515、rs34733339、rs2274976、rs3834044、rs3737964和rs4846049。本文综合考察上述10个SNP位点与冠心病相关性，为冠心病的发生提供更多理论依据，为冠心病的个体化防治提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018年10月至2020年10月在医院住院和门诊就诊的167例冠心病患者作为冠心病组，同时期收集172例健康体检者作为对照组。冠心病组入组标准：患者均为经冠状动脉造影结果确诊；冠心病组患者之间无亲缘关系；患者精神状态良好，能够正常交流。冠心病组排除标准：3个月内服用过影响牛胱氨酸(Hcy)水平的叶酸、他汀类药物患者；患有严重自身免疫系统疾病、内分泌功能异常患者；合并肿瘤、血液病患者。对照组入组标准：本研究同时期，冠状动脉造影证实冠状动脉无明显病变,在本院健康体检者作为对照组。本试验经医院伦理委员会批准,受试者均签署知情同意书同意。

1.2 检测指标 收集受试者的性别、年龄、吸烟饮酒情况、高血压病史等一般资料。并采集促凝血3 ml用于检测Hcy、血糖、总胆固醇等生化指标，同时采集EDTA抗凝血2 ml，用于提取人基因组DNA。

1.3 基因组DNA提取 应用硅膜离心法从抗凝血中提取人白细胞中基因组DNA(德国QIAamp DNA Mini and Blood Mini提取试剂盒，批号：511106)，提取的DNA经微量紫外分光光度检测浓度和纯度合格后，贮存于-80℃冰箱中。

1.4 SNP位点选择 综合文献报道，选择rs1801133(C677T)和 rs1801131(A1298G)位点，并在国家生物技术信息中心网站(The National Centerfor Biotechnology Information，NCBI；https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)搜索MTHFR基因编码区、5’端调节序列、3’端调节序列等可能降低酶活性的SNP位点,结合千人基因组计划数据库中，选择最小等位基因频率(minor allele frequency,MAF)>0.05的SNP位点，筛选出8个位点，共计研究10个SNP位点。

1.5 MTHFR基因型分型 以提取的受试者基因组DNA为模板，PCR扩增MTHFR基因目的序列，通过测序检测SNP多态性。50 μl PCR体系如下：PCR缓冲液Mix 25 μl,DNA 2 μl,浓度为10 μl的F、R游引物各1 μl,无RNase水补足至50 μl。PCR温度：94℃预变性5 min;94℃变性30 s,56℃退火45 s,72℃延伸1 min,40个循环，72℃终延伸7 min;扩增产物用毛细管电泳仪检测目的条带并进行DNA测序。

2 结果

2.1 一般资料分析 冠心病组167例，平均年龄(55.16±14.35)岁；对照组172例，平均年龄(53.62±14.95)岁。冠心病组吸烟比例、高血压比例、空腹血糖、Hcy、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、总胆固醇(TC)水平显著高于对照组(P<0.05)，冠心病组高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平显著低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 2组一般资料比较

2.2 Hard-Weinberg 平衡检验 通过基因测序得到的10个SNP位点等位基因，采用拟和优度检验，分别检验2组等位基因观测值与预期值吻合程度，Hardy-Weinberg平衡检验结果显示，冠心病组和对照组基因型观测值[observedheterozygote frequency,O(HET)]与预期值[expected heterozygote frequency,E(HET)]差异均无统计学意义(P>0.05)，表明本研究中167例冠心病患者和172例健康体检者处于Hard-Weinberg 平衡状态，10个SNP位点可以入选本研究。见表2。

表2 各SNP位点Hardy-Weinberg检验

2.3 MTHFR基因10 个SNP与冠心病单位点关联分析 在rs1801133位点，冠心病组T等位基因频率显著高于对照组(χ2=6.409，P=0.011)，基因型分布差异有统计学意义(χ2=8.054，P=0.018),rs4846049位点冠心病组T等位基因频率显著高于对照组(χ2=4.212，P=0.040)，基因型分布差异有统计学意义(χ2=7.019，P=0.030)，其余位点rs4846048、rs3737966、rs1537515、rs34733339、rs2274976、rs1801131、rs3834044和rs37379642组间等位基因频率和基因型分布差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表3。

表3 冠心病组与对照组等位基因频率比较 例(%)

2.4 连锁不平衡分析 MTHFR基因10 个SNP位点应用Haploview软件进行连锁不平衡分析，分析结果显示，10 个SNP位点存在连锁不平衡现象，出现2个区块(Block)，分别为由rs4846048、rs3737966、rs1537515组成的区块1(Block1)和由rs4846049、rs2274976、rs1801131、rs1801133组成的区块2(Block2)各位点之间存在明显连锁不平衡现象，其 D’均>0.9 且 r2均>1/3。Haploview软件进一步分析显示，10个SNP位点共构成7种单倍型，分别为区块1构成的GCC、ACC、GTA单倍型和区块2构成的TGAT、GAAC、GACC、GGAC。见图1、2。

图1 MTHFR 基因SNP位点连锁不平衡图(D’值);图上部是所选SNP在基因上的定位，下部是10个SNP位点的Haploview 连锁不平衡图

2.5 基因位点单倍体型与冠心病Logistic回归分析 单倍型Logistic回归分析以是否患有冠心病为因变量，以性别、年龄、空腹血糖、三酰甘油、总胆固醇、HDL、LDL、Hcy、BMI、高血压、吸烟史、饮酒史、单倍型作为自变量，建立Logistic回归模型。Logistic回归分析结果显示，Block2中的TGAT单倍型冠心病组与对照组存在显著差异,TGAT单倍型患冠心病风险是GGAC单倍型的2.512倍。TGAT单倍型(P=0.030)、空腹血糖(P<0.001)、三酰甘油(P=0.005)、HDL-C(P=0.005)、LDL-C(P=0.001)、Hcy(P=0.001)、高血压(P=0.014)是患冠心病的独立危险因素。见表4。

图2 MTHFR 基因位点连锁不平衡图(r2值);图上部是所选SNP在基因上的定位，下部是10个SNP位点的Haploview 连锁不平衡图

表4 基因位点单倍体型与冠心病Logistic回归分析

3 讨论

冠心病作为一种常见的心血管疾病，其病因复杂，相关研究探索了遗传因素对冠心病患病影响[2,3]。但不同种族的受试者冠心病与遗传易感位点相关性结论并不一致[4-6]。MTHFR 基因定位于人基因组1p36.3，由10 个内含子和11个外显子组成，其基因大小为2.2kb，编码的的蛋白为亚甲基四氢叶酸还原酶，此酶是叶酸代谢途径的关键酶，当该酶发生突变时，其酶活性降低，影响Hcy复甲基化代谢途径。MTHFR 基因变异程度较高，常见的突变类型有6种错义突变、1种 5’末端剪接位点处的突变和 1 种无义突变。

MTHFR基因常见的SNP位点有 rs1801133、rs1801131、rs4846048、rs4846049等，而目前MTHFR基因SNP位点与冠心病相关性研究主要集中于rs18011331和rs1801133两个位点。既往研究发现MTHFR rs1801133多态性对汉族MTHFR酶活性及冠心病的影响最大[7-9]，相关研究显示，不同种族的rs1801133等位基因分布具有差异性[10,11]。rs1801133位点位于MTHFR基因第4 外显子，在基因序列上T突变为C，缬氨酸突变为丙氨酸，并产生Hinf I 酶切位点，改变亚甲基四氢叶酸还原酶活性降低,人体蛋氨酸循环障碍,导致高Hcy血症，而高Hcy 血症被认为是心脑血管疾病的独立危险因素[12-14]。本研究结果显示，冠心病组T 等位基因频率为54.49%，显著高于对照组的44.77%，且2组不同基因型分布具有显著差异，这与湖南省和广西省等我国南方汉族人群中相关研究[15,16]结论一致。

对于MTHFR基因另一常见SNP位点rs1801131，研究结论并不一致。李亚萍等[17]研究显示，河南地区汉族人群中rs1801131位点T等位基因携带者患静脉血栓的风险更高。但周丽萍等[18]研究认为，CC基因型及C等位基因频率显著高于健康对照组。番云华等[19]研究结果显示MTHFRA1298C(rs1801131)与高同型半胱氨酸血症无相关性。本研究结果显示,rs1801131位点等位基因频率和3种基因型分布在冠心病组与对照组中差异均无统计学意义(P>0.05)。

对于其他6个SNP位点，定位于MTHFR基因3’ UTR的rs4846049位点与冠心病相关性研究较少，侯荣耀等[20]研究表明此位点与脑血管疾病相关，携带T等位基因受试者脑血管疾病发病风险显著增高，TT基因型也使缺血性卒中发病风险显著增高，本研究中此位点冠心病组T 等位基因频率显著高于对照组(P<0.05)，基因型分布差异有统计学意义(P<0.05)，表明本地区rs4846049位点是冠心病易感性位点。

rs2274976位点的突变位点为G1793A，此位点对于冠心病影响尚存在不同观点，李振华等[21]研究显示，MTHFR基因G1793A多态性与血清Hcy水平有相关性,血清Hcy水平AA突变型显著高于GG野生型，但施翎等[22]研究显示，AA型突变型未出现血浆Hcy水平升高的风险。本研究显示，冠心病组与对照组G1793A等位基因和基因型分布无差异。而rs4846048、rs3737966、rs1537515、rs34733339、rs3834044和rs3737964冠心病组与对照组等位基因和基因型分布差异均无统计学意义(P>0.05)。

对10个SNP位点进一步的单倍型分析显示，分别为由rs4846048、rs3737966、rs1537515组成的区块1和由rs4846049、rs2274976、rs1801131、rs1801133组成的区块2，各位点之间存在明显连锁不平衡现象。10个SNP位点共构成7种单倍型，分别为区块1构成的GC、AC、GT单倍型和区块2构成的GACT、GGAC、GAAT、AGAC。Logistic回归分析显示，区块1构成的3种单倍型并不是冠心病的危险因素，而区块2构成的单倍型GACT，是发生冠心病的危险性单倍型，TGAT单倍型患冠心病风险是AGAC单倍型的2.512倍。目前笔者发现MTHFR基因rs1801133等单一的SNP与冠心病相关性研究较多，但MTHFR基因多SNP位点构成的单倍型与冠心病相关性报道较少，随着分子生物学和高通量基因测序等技术的进步，长片段基因测序成本将大大降低，更有利于多位点的单倍型研究。

本研究结论还需通过扩大样本量、对多态性位点进一步行相关功能研究、选择不同人群及种族，排除其他干扰因素，进一步控制偏倚将会获取更客观、确凿的论证，为探索MTHFR基因 SNP对冠心病的影响，早期进行MTHFR基因多SNP位点检测，为指导冠心病个体化治疗提供依据，为冠心病的预防与治疗提供新方向。