miR-370调控ISG15表达对喉癌细胞增殖、迁移的影响

刘洋君 李丽 陆晓丹

喉癌的发病率占头颈部癌的第二位，患者的5年生存率较低，复发和转移是喉癌患者死亡的主要原因，因此研究喉癌细胞的迁移与转移机制具有重要意义[1,2]。微小RNA-370(MicroRNA-370，miR-370)是一种肿瘤抑制基因，可参与调控结肠癌、胶质瘤等多种肿瘤细胞的增殖、迁移等[3,4]。Shen等[5]研究表明，miR-370在结肠癌中下调表达，miR-370可靶向MDM4抑制结肠肿瘤的生长。干扰素刺激基因15(interferon stimulating gene 15，ISG15)是一种由Ⅰ型干扰素诱导的蛋白，属于泛素样蛋白超家族，其在多种恶性肿瘤中高度表达[6]。然而笔者发现miR-370与ISG15在喉癌细胞中的作用机制尚不清楚，因此，本研究通过探索过表达miR-370对喉癌细胞(LSC-1)增殖、迁移及侵袭的影响及其对ISG15的调控作用，以期寻找喉癌治疗的新靶点。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 人喉癌细胞LSC-1购于中国科学院细胞库；DMEM培养基(货号：SH40007.01)购自美国Hyclone公司；胎牛血清(货号：F8245-100)、DMSO(货号：D2650)购自Solarbio公司；miR-370过表达质粒(miR-370 mimics)及其阴性对照(miR-NC)、ISG15过表达质粒(ISG15)及其空载质粒(pcDNA)、抑制ISG15表达(si-ISG15)及其阴性对照(si-NC)质粒购自上海斯信生物科技有限公司；miR-370、ISG15、U6、GAPDH引物序列由上海吉玛制药有限公司设计合成；Matrigel胶(货号：356234)购自美国BD公司，CCK-8试剂盒(货号：C0037)、RIPA细胞裂解液(货号：P0013B)购自上海碧云天生物技术有限公司；Lipofectamine 2000(货号：11668-027)、Trizol购自美国Invitrogen公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒(货号：E1920)购自Promega公司；兔抗人ISG15(货号：ab227541)、MMP-2(货号：ab92536)、MMP-9(货号：ab228402)抗体购自英国Abcam公司。M2型全波长酶标仪购自美国MD公司；XDS-1B型显微镜购自上海光学仪器厂；ABI 7500荧光定量PCR仪购自Thermofisher。

1.2 标本来源 喉癌组织与癌旁组织标本各31例，来源于2017年7月至2020年10月在我院行手术治疗的喉癌患者，年龄37～73岁，平均年龄(55.70±9.30)岁；手术过程中取喉癌组织与癌旁组织；分期：Ⅰ期9例，Ⅱ期12例，Ⅲ期7例，Ⅳ期3例。

1.3 方法

1.3.1 实时荧光定量PCR(real-time quantification PCR，RT-qPCR)实验检测miR-370和ISG15 mRNA水平:采用RT-qPCR法检测喉癌组织与癌旁组织miR-370和ISG15 mRNA相对表达量，分别以U6、GAPDH为内参，采用2-△△Ct法计算miR-370和ISG15 mRNA相对表达量。miR-370上游引物(5’-3’)：TGCTGGGGTGGAACCT，下游引物(5’-3’)：GAACATGTCTGCGTATCTC；U6上游引物(5’-3’)：GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT，下游引物(5’-3’)：CGCTTCAGAATTTGCGTGTCAT；ISG15上游引物(5’-3’)：CTCTGAGCATCCTGGTGAGGAA，下游引物(5’-3’)：AAGGTCAGCCAGAACAGGTCGT；GAPDH上游引物(5’-3’)：GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG，下游引物(5’-3’)：ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA。

1.3.2 细胞培养及转染:复苏培养人喉癌细胞LSC-1，将LSC-1细胞接种于含有10%胎牛血清的DMEM培养基进行传代培养，待细胞生长至对数期时，取质粒按照Lipofectamine 2000说明书转染LSC-1细胞，将LSC-1细胞分为对照组、miR-NC组、miR-370 mimics组、si-NC组、si-ISG15组、miR-370 mimics+pcDNA组和miR-370 mimics+ISG15组，细胞转染6 h后更换新鲜DMEM培养液继续培养用于后续实验。检测LSC-1细胞miR-370表达和ISG15蛋白表达以验证转染效率。

1.3.3 双荧光素酶报告基因检测实验:根据生物信息学软件预测显示，miR-370与ISG15 3’UTR有结合区域，ISG15可能是miR-370的靶基因，根据二者结合序列区域，分别构建野生型ISG15-3’UTR-WT和突变型ISG15-3’UTR-MUT质粒，取上述质粒分别与miR-370 mimics、miR-NC共转染LSC-1细胞24 h，分为ISG15-3’UTR-WT+miR-NC组、ISG15-3’UTR-WT+miR-370 mimics组、ISG15-3’UTR-MUT+miR-370 mimics组和ISG15-3’UTR-MUT+miR-NC组，根据双荧光素酶报告基因试剂盒测定荧光素酶活性。

1.3.4 细胞计数试剂盒8(CCK-8)法检测细胞增殖:转染后的各组LSC-1细胞接种至96孔板中，分别培养24、48、72 h后，每孔加入10 μl的CCK-8溶液，37℃继续培养2 h后，在酶标仪450 nm处检测吸光度(OD)值，绘制细胞生长曲线。

1.3.5 Transwell小室检测细胞迁移与侵袭:细胞迁移实验：使用无血清的DMEM培养基将各组LSC-1细胞制备成4×105个/ml的细胞悬液，Transwell小室上室加入200 μl细胞悬液，下室加入600 μl含10%胎牛血清的DMEM培养基，在37℃含5% CO2培养箱培养24 h 后，下室用4%多聚甲醛固定20 min，0.5%结晶紫染色10 min，倒置显微镜观察，随机观察6个视野的穿过微孔膜细胞数。细胞侵袭实验：Matrigel基质胶溶解后均匀的铺于Transwell小室上室，调整各组LSC-1细胞为4×105个/ml的细胞悬液，Transwell小室加入200 μl细胞悬液，下室加入600 μl含10%胎牛血清的DMEM培养基，培养24 h后，其余步骤同迁移实验。

1.3.6 免疫印迹法(western blotting，WB)检测ISG15、MMP-2、MMP-9蛋白表达:转染后LSC-1细胞在6孔板培养48 h，加入200 μl RIPA细胞裂解液与蛋白酶抑制剂的混合液裂解30min，离心取上清液，BCA法检测蛋白浓度，取30 μg蛋白进行电泳，转膜后，5%脱脂奶粉封闭1 h，分别加入稀释后的ISG15、MMP-2、MMP-9抗体和β-actin(1∶500)抗体，4℃孵育过夜，TBST洗涤，添加相应二抗室温孵育2 h，凝胶成像系统成像，使用Quantity One软件分析条带灰度值。

2 结果

2.1 miR-370、ISG15在喉癌组织中的表达 癌旁组织中miR-370表达水平为(1.05±0.12)，ISG15 mRNA表达水平为(1.01±0.14)；喉癌组织中miR-370表达水平为(0.43±0.07)，ISG15 mRNA表达水平为(2.51±0.47)，癌旁组织与喉癌组织miR-370、ISG15 mRNA表达水平比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 miR-370与ISG15靶向关系 数据库预测发现，miR-370与ISG15 mRNA 3’UTR区有结合位点。双荧光素酶报告基因检测结果显示，miR-370 mimics与野生型ISG15质粒共转染LSC-1细胞后，荧光素酶活性显著降低(P<0.05)。表明miR-370与ISG15存在靶向关系。见表1，图1。

表1 双荧光素酶报告基因检测结果

图1 miR-370与ISG15 mRNA结合位点预测结果

2.3 过表达miR-370对LSC-1细胞ISG15表达及增殖、迁移与侵袭的影响 转染miR-370 mimics后，与对照组和miR-NC组相比，miR-370 mimics组LSC-1细胞增殖、迁移、侵袭能力与ISG15、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，miR-370表达显著升高(P<0.05)。表明过表达miR-370可显著抑制LSC-1细胞增殖、迁移与侵袭。见图2，表2。

图2 过表达miR-370对LSC-1细胞ISG15表达及增殖、迁移与侵袭的影响；A 过表达miR-370对LSC-1细胞增殖的影响；B 3组LSC-1细胞ISG15、MMP-2、MMP-9蛋白表达电泳图(1 对照组；2 miR-NC组；3 miR-370 mimics组)；C 3组LSC-1细胞迁移与侵袭(结晶紫染色×400)

表2 过表达miR-370对LSC-1细胞ISG15蛋白表达、迁移与侵袭的影响

2.4 抑制ISG15表达对LSC-1细胞增殖、迁移与侵袭的影响 LSC-1细胞转染si-ISG15质粒后，与对照组和si-NC组相比，si-ISG15组LSC-1细胞增殖、迁移、侵袭能力和ISG15、MMP-2、MMP-9蛋白表达量显著降低(P<0.05)，表明下调ISG15表达可显著抑制LSC-1细胞增殖、迁移和侵袭。见表3，图3。

表3 抑制ISG15表达对LSC-1细胞迁移与侵袭的影响

图3 抑制ISG15表达对LSC-1细胞增殖、迁移与侵袭的影响；A 抑制ISG15表达对LSC-1细胞增殖的影响；B 3组LSC-1细胞ISG15、MMP-2、MMP-9蛋白表达电泳图(1 对照组；2 si-NC组；3 si-ISG15组)；C 3组LSC-1细胞迁移与侵袭图(结晶紫染色×400)

2.5 过表达ISG15可逆转过表达miR-370对LSC-1细胞增殖、迁移与侵袭的抑制作用 将ISG15过表达质粒与miR-370 mimics质粒共转染LSC-1细胞后，LSC-1细胞增殖、迁移和侵袭能力显著升高，主要表现为ISG15、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。表明过表达ISG15可部分逆转过表达miR-370对LSC-1细胞增殖、迁移与侵袭的抑制作用。见图4，表4。

表4 过表达miR-370基础上过表达ISG15对LSC-1细胞迁移与侵袭的影响

图4 过表达ISG15可逆转过表达miR-370对LSC-1细胞增殖、迁移与侵袭的抑制作用;A 过表达miR-370基础上过表达ISG15对LSC-1细胞增殖的影响; B 3组LSC-1细胞ISG15、MMP-2、MMP-9蛋白表达电泳图(1 miR-370 mimics组；2 miR-370 mimics+pcDNA组；3 miR-370 mimics+ISG15组);C 3组LSC-1细胞迁移与侵袭图(结晶紫染色×400)

3 讨论

多项报道显示，miRNAs参与调节喉癌细胞增殖、凋亡和肿瘤细胞耐药性等过程，与喉癌的发生发展密切相关，miR-370为抑癌基因，其异常表达与卵巢癌、乳腺癌、胶质瘤等肿瘤的发生有关[7-9]。有研究显示，喉鳞状细胞癌(LSCC)组织中miR-370表达下调，miR-370可能靶向FoxM1抑制Hep2细胞增殖[10]。本研究结果显示，喉癌组织中LSC-1中miR-370表达下调，与先前报道[7,8]一致。本研究将miR-370过表达质粒转染LSC-1细胞发现，与对照组和miR-NC组相比，miR-370 mimics组LSC-1细胞增殖、迁移、侵袭能力与MMP-2、MMP-9蛋白表达水平显著降低，表明过表达miR-370可显著抑制LSC-1细胞增殖、迁移与侵袭，提示miR-370可能在喉癌中发挥抑癌作用。此外，研究显示，miR-370还可抑制胃癌、肝癌等肿瘤细胞的迁移与侵袭[9]，与本研究结果一致。钱丽丽等[10]研究表明，在肿瘤坏死因子(TNF)-α诱导的肝癌细胞中，miR-370可靶向叉头框基因(Fox)抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭。

miRNAs通过对下游靶蛋白的调控而参与调控肿瘤细胞的增殖与迁移是肿瘤生成与转移的重要基础，本研究通过生物信息学软件预测发现，miR-370与ISG15有结合位点。ISG15作为一个IFN刺激蛋白，其单体及共价修饰蛋白在肿瘤的发生发展中发挥重要作用，在多数肿瘤中，ISG15上调表达，且与肿瘤的恶性程度和不良预后有关[11,12]。研究表明，在胰腺导管腺癌(PDAC)细胞中，敲低ISG15表达，可抑制细胞增殖和集落形成，导致CD8+肿瘤浸润淋巴细胞数量增加和胰腺肿瘤生长减少[13]。本研究结果显示，LSC-1细胞中转染si-ISG15质粒以下调ISG15表达后，LSC-1细胞增殖、迁移和侵袭能力和MMP-2、MMP-9蛋白表达显著降低，表明下调ISG15表达可显著抑制LSC-1细胞增殖、迁移和侵袭。另有研究显示，ISG15在结肠癌组织中高表达，ISG15上调与结肠癌患者预后不良密切相关，ISG15表达上调可促进结肠癌细胞的体外迁移和增殖，而ISG15表达下调可抑制结肠癌细胞的增殖和转移，此外，下调ISG15可以增强曲美替尼对结肠癌细胞的抗癌作用[14]。本研究经过双荧光素酶报告基因检测显示，miR-370与ISG15存在靶向关系。另外本研究也显示，在LSC-1细胞中，miR-370的上调可抑制ISG15表达，且过表达ISG15可部分逆转过表达miR-370对LSC-1细胞增殖、迁移与侵袭的抑制作用。Liu等[15]研究表明，miR-370可靶向调控ISG15表达，调控肝癌细胞对IFN-α的敏感性，也证实了miR-370与ISG15存在靶向关系。以上这些结果表明miR-370可通过靶向抑制ISG15表达，影响LSC-1细胞增殖、迁移与侵袭。

综上所述，过表达miR-370可通过靶向抑制ISG15表达而抑制人喉癌细胞的增殖、迁移及侵袭，本研究仅对相关机制进行了初步研究，具体作用机制有待进一步研究。