利用前景与背景选择技术进行节水抗旱稻加值育种

刘 毅,孔德艳,王飞名,张安宁,刘国兰,余新桥,罗利军

(上海市农业生物基因中心,上海 201106)

高产和稳产是作物育种最基本和最重要的目标。在水资源日益短缺、耕地面积减少、气候变化带来的非生物和生物胁迫愈加严重的不利影响下,提高和稳定作物产量是育种面临的严峻挑战。近年来,包括持久的抗病虫害能力、非生物胁迫耐受性以及养分和水分利用效率等与产量稳定性和可持续性相关性状的改良越来越受到广泛的关注[1-3]。

然而,上述性状大多为数量性状,在DNA分子标记技术出现之前,快速发现微效多基因控制的复杂数量性状位点(QTL)是极其困难的[4]。分子标记技术促进了作物遗传学的发展,DNA标记能够检测潜在性状基因的等位变异,为作物遗传育种提供了便利。分子标记辅助选择(Marker-assisted selection,MAS),是指利用与目的基因紧密连锁的分子标记或共分离的功能标记,对个体的目标基因进行检测,从而在群体中筛选获得期望的个体,是一种将分子标记应用于作物育种的辅助选择手段,可以大大提高育种效率和精度[5]。全基因组选择是指在利用分子标记对目标基因进行选择的同时,也利用分布于全基因组的与目标基因非连锁的分子标记对遗传背景进行选择,从而实现对目标基因和遗传背景的共同选择,达到定向改良目标性状目的[6]。分子标记在质量性状和主效QTL,如抗病虫基因渗入、聚合等方面展现出很高的效率。节水抗旱稻是通过水旱稻杂交,结合在目标环境强胁迫条件下筛选培育的既具有水稻的高产优质,又具有旱稻的节水抗旱特性的一种新的栽培稻类型,在节水抗旱的遗传背景下,利用分子标记辅助技术,增添其他有价值绿色性状的加值育种,为选育少打农药、少施化肥、节水抗旱、优质高产的绿色超级稻提供了可行、有效的途径。本研究主要介绍利用分子标记前景和背景选择技术进行节水抗旱稻加值育种的研究进展,总结加值育种过程中的经验,并对今后需要关注的关键性状和方向进行展望。

1 分子标记

DNA分子标记是揭示突变∕变异的DNA片段,可用于检测群体或基因库中特定DNA序列的不同基因类型或等位基因之间的多态性。在分子标记辅助选择育种中,有效使用的理想DNA标记应具备以下标准:(1)多态性强;(2)在全基因组均匀分布(不是在特定区域集中);(3)共显性(可以区分纯合和杂合);(4)不同等位基因的特征容易辨别;(5)单拷贝;(6)使用成本低,便于分析和高通量自动化。目前作物遗传育种中应用比较广泛的是基于PCR检测的SSR(Simple sequence repeat)和SNP(Simple nucleotide polymorphisms)标记[7-8]。

2 分子标记辅助回交育种

分子标记辅助回交育种(Marker-assisted backcrossing,MABC)是MAS主要应用之一,目的是在不改变受体遗传背景的情况下,将一个或多个有利基因从一个品系(供体)导入到另一个品系(受体)。主要选择过程为:(1)选择一个综合表现较好、部分性状待改良的亲本作为受体,携带目标基因的亲本作为供体,受体和供体杂交;(2)利用目标基因的分子标记检测杂合基因型F1代,并与轮回亲本回交;(3)在BC1F1群体继续利用分子标记检测,选择目标基因杂合的单株与轮回亲本回交,根据实际需求可连续回交3—4代。(4)在BC4F2群体中,利用分子标记筛选目标基因纯合单株,自交收种进行下一步评价。

分子标记辅助回交的效率取决于许多因素,包括每个回交世代群体的大小、分子标记与目标基因的遗传距离以及使用标记的数量等,传统回交育种恢复到轮回亲本99%的遗传背景可能需要6—8代,结合分子标记的前景选择、重组选择、背景选择,标记辅助回交育种仅需要3—4代,可以极大加速回交计划[9-10]。

2.1 前景选择

前景选择是基于分子标记检测结果,选择携带供体目标基因的个体,以确保基因在杂交和回交过程不会丢失,并且在自交阶段以纯合的形式固定下来。前景选择最早由Tanksley等[11]提出,可以在作物苗期阶段进行标记检测,以便选择最合适的单株进行回交,对表型筛选过程费力或耗时的性状特别有用。

2.2 重组选择

重组选择的目的是减少含有目标基因的供体基因组片段的大小。在回交过程中,与其他染色体相比,携带目标基因的染色体上的轮回亲本基因组恢复得更慢,因为很难打破与目标基因连锁的供体基因组片段。特别是当这些连锁区段存在控制不良农艺性状的基因时,会带来一些连锁累赘的问题。需要选择使用位于目标基因两侧的标记,在至少两个回交世代检测重组的发生,最终获得在两个侧翼标记上是受体等位基因,而在目标基因座上具有供体等位基因的个体[26]。

2.3 背景选择

背景选择是借助标记信息对受体的遗传背景进行选择,以加快受体遗传背景的恢复速度。在背景选择中所用到的标记是与目标基因不连锁的,除目标基因外,其他所有标记尽可能选择受体亲本的基因型,受体基因组恢复的进展取决于所用标记数量,标记数量越多,恢复的速度越快,但是需要更大的群体规模和更多的基因分型[8]。

近年来,利用水稻抗病虫和米质相关的前景选择标记(表1),笔者团队以节水抗旱稻主要亲本为受体,以携带不同抗性基因的种质资源为供体,通过分子标记辅助选择和常规育种相结合的手段,创制了一批富含绿色性状的新种质[27]。安正帅等[28]利用分子标记辅助回交育种的方式,将稻瘟病抗性基因(Pi1,Pi2和Pi9)导入节水抗旱稻保持系沪旱1B和恢复系旱恢3号中,稻瘟病抗性鉴定结果表明,携带抗性基因的改良株系抗病性显著高于其轮回亲本。刘毅等[29]利用白叶枯病抗性基因Xa23来改良节水抗旱稻亲本沪旱1B的抗性,获得了白叶枯病抗性显著提高的改良保持系及其不育系。张安宁等[30]将褐飞虱抗性基因Bph6、Bph9、Bph14和Bph15单独或聚合的方式导入到节水抗旱稻亲本旱恢3号中,获得了一系列含有1—4个褐飞虱抗性基因的改良株系,并对这些改良株系进行效应评价,结果表明:多基因聚合改良株系抗性优于单基因改良系,Bph9的褐飞虱抗性最强。通过分子标记辅助选择、常规杂交结合在目标环境高强度胁迫筛选,Liu等[31]将广谱抗稻瘟病基因Pi9、Pi54和Pi5导入到节水抗旱两系不育系沪旱1S中,获得一个新的节水抗旱稻光温敏核不育系沪旱74S,14个稻瘟病菌的人工接种鉴定表明:沪旱74S抗性频率为85.7%,在田间自然诱发条件下,沪旱74S及其杂交组合对苗瘟和穗颈瘟也表现出较好的抗性。Liu等[15]根据软米基因Wxhp基因第4外显子第77位碱基A∕G的SNP突变位点设计开发了特异引物,可以准确进行基因型鉴定,利用软米基因Wxhp可在改良南方籼稻品种食味品质方面发挥重要作用。

表1 抗性基因前景选择标记Table 1 Foreground selection markers for resistance genes

3 全基因组分子标记背景选择育种

随着测序技术的发展和检测成本的降低,在全基因组范围内进行背景选择成为可能。通过基因组测序,可以获得大量的SNP标记,实现对基因组的高密度覆盖,显著提高选择的准确性,在全基因组选择育种中具有广泛的应用前景[32]。Wing等[33]提出利用基因组育种技术培育绿色超级稻的策略。基因组育种包括两个组成部分:基因组设计和全基因组选择。基因组设计是以特定的优良品种为受体或底盘亲本,设计在目标区域种植所需要的性状以及这些性状涉及到的基因∕标记,然后收集包含这些目标基因的种质资源作为供体,确定组装这些基因并将其导入底盘品种中的技术路线。全基因组选择包括基因分型平台和基因特异性选择系统,分别对目标基因和基因组背景进行选择。基因分型平台采用的是育种芯片,利用大规模重测序项目和水稻功能基因组研究成果,已经开发设计制作了3款水稻SNP基因芯片(RICE6K、RICE60K、RICE90K),分别有4 500个、4.3万个、8.5万个高质量SNP标记位点数目[34-36]。基于对来自全球89个国家和地区的3 024份水稻样品进行全基因组重测序的信息,华智生物技术有限公司与中国农业科学院合作开发了水稻56 K高密度SNP芯片,包含约5.6万个SNP标记,其中4 700多个SNP标记与已知的2 300多个水稻功能基因紧密连锁。随着基因型检测技术的发展,基于靶向测序基因型检测的液相芯片技术更加灵活,成本更低,同一套标记可以通过控制测序深度,应对不同标记密度的检测要求[37]。基因特异性选择系统包括选择目标基因的功能标记和每个目标基因两个侧翼用来检测供体和受体基因组之间重组的DNA标记,便于选择目标基因已被精确导入的品系。

种植多系品种可以提高作物群体的遗传多样性,是一种控制病虫害的生态学方法。Zhu等[38]提出将具有相似背景的抗病(80%—90%)和感病(10%—20%)品种混合种植可有效减少稻瘟病新生理小种的形成,制约稻瘟病菌的快速变异,延长水稻抗病品种的使用年限。利用分子标记前景和全基因组背景策略进行多系品种选育有两个优点:一是提高了效率,纯合改良系在3年基本可以获得,而传统常规育种方法需要5—6年;二是除了能将抗性基因准确导入受体亲本,减少遗传累赘,获得遗传背景基本一致、农艺性状相似、携带不同抗性基因的近等基因系,为作物获得持久抗性提供了一种思路。此外,不同性状的基因可以很容易地通过一个杂交组合成一个同质的遗传背景。因此,可以通过将多个基因整合到一个单独的品系中来培育多抗绿色超级稻品种[33]。节水抗旱稻杂交组合‘旱优73’是目前长三角推广面积最大的品种,由不育系沪旱7A和恢复系旱恢3号选育而来[39]。笔者团队采用全基因组背景选择育种的方法,将不同稻瘟病抗性基因(Pi2、Pi9、Pigm)、白叶枯病抗性基因(xa5、Xa21、Xa23)、褐飞虱抗性基因(Bph6、Bph9、Bph14)分别导入到恢复系旱恢3号中,在杂交和回交过程利用目标基因的分子标记进行前景选择;在BC1F1和BC2F1个体中,利用SNP芯片进行全基因组背景分析,筛选轮回亲本背景回复率最高的个体进行回交;在BC3F1个体中,利用48对SSR标记[40]进行背景检测,选择48对SSR标记差异最小的单株自交收种;在BC3F2群体中,利用目标基因分子标记和差异SSR标记作为前景选择标记,筛选目标基因纯合且差异SSR标记与轮回亲本一致的个体自交收种,进行下一步抗旱性和农艺性状评价。在构建单个抗性基因的等基因系时,在不同的回交世代,可以根据需要选择相应目标基因的个体杂交进行不同抗性基因的聚合(图1)。经过这样的选择方式,获得了平均遗传背景与旱恢3号相似性为97.5%的近等基因系和三基因聚合系,这些改良系及与不育系沪旱7A配制的组合农艺性状基本一致,为提高节水抗旱稻品种抗病虫能力,延长品种生命周期提供了可行的技术手段。

图1 分子标记前景和背景选择进行加值育种Fig.1 Molecular marker foreground and background selection for value-added breeding

4 基于分子标记辅助选择的节水抗旱稻加值育种

节水抗旱是绿色超级稻重要的性状之一,然而,植物的抗旱性是极其复杂的,受到多基因控制和环境影响。尽管寻找抗旱基因并将其应用于育种实践一直是一个热门的研究课题,但到目前为止,利用这些基因培育抗旱品种并将其应用于实践的报道还很少。实际上,正如Pennisi[41]指出,在基因组学揭示的大量候选抗旱基因中,几乎在田间旱胁迫条件下很难有表型。这是因为抗旱性是一个复杂的性状,受到数千个抗旱基因及其与环境的交互作用的影响[42-43]。抗旱的形成是多个抗旱基因相互作用的系统网络的结果,而不是单个抗旱基因的结果。为此,许多研究者提出了一种聚合不同抗旱机制基因的育种策略[44-45],节水抗旱稻即通过常规育种方法导入旱稻的避旱基因和水稻的耐旱基因而选育而成。经过20多年的努力,目前已经成功培育了20多个节水抗旱稻新品种,这些新品种在我国旱地和灌溉生态系统中都有种植,部分在亚洲和非洲各国示范种植表现良好,在中国累计推广面积超过百万公顷[46]。笔者团队利用分子标记辅助选择,将抗病虫基因导入到节水抗旱稻亲本中,获得了抗性显著提高的改良亲本,表明以节水抗旱稻为底盘品种,利用分子标记前景选择和背景选择,是选育绿色超级稻一种有效的途径。

Wei等[47-48]研究表明,常规杂交结合在目标环境高强度胁迫选择下,大量的干旱适应和抗旱转录调控网络中的基因被保留并聚集在育种后代的基因组中。依据这个育种策略,笔者利用分子标记前景选择将3个抗稻瘟病基因通过杂交的方式导入节水抗旱稻亲本沪旱1S中,在确定3个抗性基因纯合的前提下,进行避旱性、耐旱性、产量及品质性状的交替筛选,新育的光温敏核不育系沪旱74S抗旱性与沪旱1S一致,抗病性显著提高,验证了分子标记结合逆境胁迫选择的高效性[31]。在育种实践中发现,在同类抗性基因聚合中,存在明显的加性效应,多基因聚合的改良系抗性水平高于单基因导入系,对稻瘟病抗性基因而言,Pi2、Pi9、Pi25、Pigm在多个节水抗旱稻亲本(籼或者粳)遗传背景下均表现出广谱的抗性;对于白叶枯病抗性基因,抗性效应是xa5＞Xa23＞Xa21,xa5基因兼具抗细菌性条斑病,但由于是隐性抗性基因,适合在常规稻抗白叶枯病改良中利用[49-50]。抗褐飞虱单基因的抗性效应是Bph9＞Bph6＞Bph15＞Bph14,但聚合两个抗性基因以上的改良系的结实率低于受体亲本[30]。为了减少遗传累赘,利用全基因组选择恢复受体遗传背景,加快回交育种进程,获得了3个不同类型抗病虫基因(Pi9、Bph6和Xa23)聚合的改良系,背景回复率高达97.5%,综合农艺性状与轮回亲本保持一致,无明显差异,但稻瘟病、褐飞虱和白叶枯抗性水平显著高于轮回亲本,达到了精准定向改良的目的(图1)。

5 展望

以节水抗旱稻为代表的绿色超级稻的成功推广应用,在生产上大面积实现了“资源节约、环境友好”的绿色农业生产目标。节水抗旱稻加值育种的目标是在保留抗旱性的遗传背景下,选育多抗、优质、适应轻简化栽培的新种质,培育绿色低碳的节水抗旱稻新品种。第一,利用分子标记辅助选择,创制了富含抗病虫基因的节水抗旱稻新种质和育种中间材料,以此为供体可以大大减少直接从地方种质资源或野生稻中利用这些抗性基因的难度和时间。在加值育种过程中,除了通过回交和背景选择尽可能保持节水抗旱的遗传背景,分离世代还是应该坚持在没有犁底层的旱地(山地)选择避旱性,在水分胁迫的旱田选择耐旱性,在灌溉的水田选择高产性状,通过交替筛选整合不同的抗旱机制。第二,加值育种应注重稻米品质特别是优良食味、营养功能等性状的改良,提高稻米的经济价值,满足人们对美好生活的向往以及特殊人群的需求。第三,加强耐盐碱、高光效等性状的筛选和利用,进一步拓展节水抗旱稻品种应用面积和区域,保障粮食安全。第四,关注适应轻简化栽培的性状,如低氧萌发、早生快长、抗除草剂、抗倒伏等有利等位基因,推广直播旱管、低碳环保的种植模式。第五,利用基因组编辑技术实现目标性状的快速精准改良。第六,陆稻在旱作驯化中受到双向选择,蕴藏丰富的节水抗旱、养分高效、易栽培等绿色遗传资源,加强对陆稻基因资源的挖掘和利用,解析重要基因资源的分子机制,并在此基础上创制科学、高效、可行的分子设计育种方案。