利用CRISPR/Cas9 技术构建脂多糖结合蛋白基因敲除小鼠

李思迪, 付 彬, 郭中坤, 林颖杰,2, 张振宇, 米传靓, 王可洲

(1. 山东第一医科大学(山东省医学科学院)实验动物学院(省实验动物中心),济南 250002; 2. 山东第一医科大学附属皮肤病医院(山东省皮肤病医院),山东省皮肤病性病防治研究所,济南 250022)

脂多糖结合蛋白（lipopolysaccaride binding protein，LBP）作为一种糖蛋白，是LBP家族成员之一［1］。LBP的相对分子质量为60 000，其蛋白质部分是相对分子质量为50 000 的单链多肽［2-3］。LBP 分布广泛，在啮齿类动物的心、肝、肺等多个器官中均有表达，其中在肝脏中的表达水平较高。人和动物血清中的LBP 主要与脂多糖（lipopolysaccharide，LPS） 结合发挥作用［4］。LPS 又被称为内毒素，是革兰阴性菌外膜上的主要成分之一，可以促进炎性发生，引起机体各种疾病，严重时甚至会导致机体死亡［5］。研究表明，LBP与多种疾病的发生发展相关。如Heizhati 等［6］在研究LBP 对睡眠结构影响的实验中发现，血清LBP 高浓度与中年男性高血压患者睡眠第一阶段时间延长相关；Pal 等［7］在研究与帕金森病有关的胃肠道炎性标志物时，发现LBP 是一种与LPS 神经毒性相关的胃肠道生物标志物。He等［8］在研究LPS诱导下LBP编码基因缺失（Lbp-/-）SD大鼠的转录水平及其在脓毒症期间对肝脏的影响时发现，当核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）的活性受到抑制时，Lbp基因缺失会影响过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferators activated receptor，PPAR）信号通路，从而影响细菌清除。Li等［9］研究了牛野生型LBP和突变型LBP（67Ala变Thr）对LPS 诱导牛乳腺上皮细胞（bovine mammary epithelial cells，BMEC）炎性反应的影响，发现5 μg/mL突变型LBP处理BMEC 导致的细胞凋亡率高于野生型LBP，且没有细胞毒性。这些相关研究揭示了LBP与LPS 结合可导致炎性反应的发生，但对其具体作用机制的研究还不够深入。为探索LPS在Lbp基因敲除小鼠体内如何诱导炎性反应发生、发展，本文将外显子2的全部序列与外显子3的部分序列特异剪切，建立Lbp基因敲除小鼠模型，为进一步研究LBP 蛋白在免疫方面的作用机制和生理作用提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF 级C57BL/6J 小鼠和ICR 小鼠均购自北京唯尚立德生物科技有限公司［SCXK（京）2016-0009］，饲养于山东省实验动物中心［SYXK（鲁）2019-0007］，饲料购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，并经60Co灭菌。实验动物使用遵循3R原则，且获得山东省实验动物中心伦理委员会批准（20181224-01）。

1.2 主要试剂与仪器

实验所用试剂：Cas9 mRNA、Cas9/gRNA 靶点效率检测试剂盒（VK007）购自北京唯尚立德生物科技有限公司；Hi Scribe T7 ARCA mRNA试剂盒（E2065S）购自美国New England Biolabs 公司；人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）（181223）、血促性素（pregnant mare serum gonadotrophin，PMSG）（1905152） 购自宁波第二激素厂；pClone007 Blunt Simple VECTOR Kit （OCE20601） 、 金 牌 mix（TSE101）、动物组织/细胞基因组DNA 提取试剂盒（0180331AX）均购自北京擎科生物科技有限公司；Total RNA Kit Ⅱ（R6934-02）购自美国Omega 公司；通用抗体稀释液（U3635）购自美国Sigma公司；高效抗 体 稀 释 液 （WA-002） 购 自 美 国 Invent Biotechnologies 公司；高效RIPA 组织/细胞快速裂解液（R0010）购自北京索莱宝科技有限公司；一抗β-actin（4970S）、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP） 标 记 的 抗 兔IgG 二 抗（7074S） 均 购 自Cell Signaling Technology 公司；一抗LBP（PA5-79586）购自美国Invitrogen公司。

实验所用仪器：拉针仪（PN-31） 购自日本Narishige 公司；高速冷冻离心机（5424R）购自德国Eppendorf 公司；凝胶成像仪（Universal HoodⅡ）购自美国Bio-Rad公司；体视显微镜（SMZ745T）购自日本Nikon 公司；PCR 仪（Mastercycler X50s） 购自德国Eppendorf 公司；显微注射用显微镜（IX73P1F）购自日本Olympus 公司；电泳仪（PowerPac™Basic）购自美国Bio-Rad公司。

1.3 Lbp基因sgRNA靶点设计及制备

根据数据NCBI-Gene ID：16803及Ensembl-Gene：LbpENSMUSG00000016024 可得Lbp基因的序列结构、保守区域及转录产物等信息，依据这些信息设计小向导RNA（small guide RNA，sgRNA）的靶点。对Lbp基因的序列进行分析后，本实验选择剪切2 号外显子全部序列及3 号外显子部分序列，图1 为靶点剪切示意图。靶点设计完成后进行体外转录，并检测转录产物活性，筛选出酶切活性较高的sgRNA 靶点备用。同时参照Hi Scribe T7 ARCA mRNA 试剂盒说明书制备Cas9 mRNA。

图1 Lbp基因敲除示意图Figure 1 Lbp gene knockout diagram

1.4 胚胎移植及其前期准备

准备4 周龄C57BL/6J 雌鼠和8～12 周龄C57BL/6J雄鼠。雌鼠腹腔注射PMSG 0.1 mL（5 U）/只，48 h 后腹腔注射hCG 0.1 mL（5U）/只，18 h 后取卵子备用。取雄鼠附睾，再从附睾中取出精子。

取出的精子在获能液中获能后，选取活力较好的精子滴加到经过短暂培养的卵细胞中，经3～4 h 体外受精获得受精卵。用RNA-free 水配制sgRNA&Cas9 mRNA 混合物（sgRNA 25 ng/μL，Cas9 mRNA 50 ng/μL），借助显微注射系统将其注射到受精卵内。将注射sgRNA&Cas9 mRNA 混合物的受精卵移植到经12.5 mg/mL 三溴乙醇腹腔注射麻醉后的假孕ICR 雌鼠输卵管中，将代孕ICR 雌鼠置于独立通气笼盒（individual ventilated cages，IVC）中饲养，待小鼠出生后鉴定基因型。

1.5 Lbp基因敲除小鼠的获得及鉴定

将代孕ICR雌鼠生产的仔鼠作为Founder并命名为F0代，F0代出生2 周后，剪小鼠的脚趾进行编号，使用基因组提取试剂盒提取小鼠基因组。使用正向引物（F： CATTTGTTTGGGAACCCC） 和 反 向 引 物（R：AAGGGCTGGAATGCTAATG）进行PCR 扩增。PCR 反应体系：TSE101 mix 15 μL、上游引物0.6 μL、下游引物0.6 μL、DNA 1.2 μL、ddH2O 2.6 μL。反应条件：94 ℃预变性4 min；98 ℃变性20 s，59 ℃退火40 s，72 ℃延伸55 s，共35个循环；68 ℃延伸10 min；10 ℃保持。PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳，目的条带切胶回收进行平末端克隆、转化、涂板，并挑单克隆测序验证。结合基因组鉴定和测序结果：只出现770 bp 左右的目的条带，且测序显示单链缺失1 457 bp 的判断为Lbp-/-；只出现2 153 bp 左右的野生型（wild type，WT）条带，且测序显示与WT一致的判断为Lbp+/+；出现770 bp 左右的目的条带及2 153 bp 左右的WT 条带，且770 bp 左右目的条带测序显示单链缺失1 457 bp的 判 断 为Lbp+/-。 F0 代 后 新 增 引 物 WT-R（TGCCTGACCCAAGAGGTTT），对引物F/R基因鉴定结果进一步验证：F/WT-R出现810 bp左右的WT条带的为Lbp+/+或Lbp+/-，未出现任何条带的为Lbp-/-。F0 代小鼠进行基因组鉴定测序后，选出Lbp+/-小鼠与WT 小鼠交配，生产的后代为F1代；F1代小鼠基因组鉴定测序后，选出Lbp+/-小鼠自交，生产的后代为F2 代；F2 代小鼠基因组鉴定及测序后，选出Lbp+/-小鼠自交，生产的后代为F3 代；F3 代小鼠继续进行基因组鉴定及测序。

1.6 RT-PCR 测序鉴定Lbp 基因敲除小鼠的mRNA转录

使用Total RNA Kit Ⅱ试剂盒提取组织总RNA，将总RNA 反转录为cDNA， 使用正向引物（F：TGCTCTCTACATTGCTGGGG） 和 反 向 引 物 （R：GGAGGTCCACTGAAATGGTG） 进行PCR 扩增。PCR反应体系：TSE101 mix 10 μL、上游引物0.4 μL、下游引物0.4 μL、cDNA 1 μL、ddH2O 3.2 μL。反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，52 ℃退火50 s，72 ℃延伸30 s，共35 个循环；72 ℃延伸5 min；10 ℃保持。PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳，目的条带切胶回收后进行平末端克隆、转化、涂板、挑单克隆测序验证。结合PCR 结果和测序结果：只出现121 bp 左右目的条带，且测序显示单链缺失244 bp 的判断为Lbp-/-；只出现365 bp左右WT条带，且测序显示与WT一致的判断为Lbp+/+；出现121 bp 左右目的条带及365 bp 左右WT 条带，且121 bp 左右目的条带测序显示单链缺失244 bp的判断为Lbp+/-。

1.7 蛋白质印迹法检测Lbp 基因敲除小鼠的LBP蛋白表达

因NCBI 及MGI 数据提示LBP 在肝脏中表达量较高，故本实验选取肝脏组织蛋白进行蛋白质印迹实验。取WT 小鼠、Lbp敲除杂合子鼠（Lbp+/-）及Lbp敲除纯合子鼠（Lbp-/-）的肝脏组织，加入预冷的蛋白裂解液与蛋白酶抑制剂，组织破碎后冰上反应30 min，4 ℃14 000×g离心5 min，取上清液并用改良型Bradford 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。然后加5×蛋白Loading 于100 ℃煮沸10 min，用5%的浓缩胶与8%的分离胶分离蛋白，0.2 A、1.5 V 转膜50 min，5%的脱脂奶粉37 ℃封闭2 h，用预冷的TBST 洗3 次（每次10 min），加入一抗（β-actin 及兔抗小鼠LBP 抗体均1∶1 000 稀释）且4 ℃孵育过夜，第二天用预冷的TBST洗3次（每次10 min），加入二抗（HRP标记的抗兔β-actin IgG 以1∶2 000 稀释，HRP 标记的抗兔LBP IgG 以1∶10 000 稀释）且37 ℃孵育2 h，用预冷的TBST 洗3次（每次10 min），Immobilon Western 化学发光HRP底物（ECL发光试剂）显色后凝胶成像仪成像。

2 结果

2.1 根据Lbp 基因组结构设计CRISPR/gRNA靶点

通过NCBI 及Ensembl 网站查询可知，Lbp基因有5个转录产物，其中3 个可翻译为蛋白质。对该基因蛋白功能保守区域及基因序列相关信息分析发现，2、3号两个公共外显子位于功能保守区BPI/LBP/CETP N 端区，剪切位点位于42～123 aa 处，其蛋白编码区的碱基数为244，非3的倍数，剪切后造成移码突变，从而导致蛋白失活。最终我们选择Lbp-201 作为敲除转录模板。在2号外显子一端与3号外显子中间部位设计靶点，靶点序列信息如表1 所示。针对上述设计的多个sgRNA 靶点，使用sgRNA 体外酶切活性检测试剂盒检测其体外酶切活性，根据靶点活性检测结果，本实验选择Lbp-L4和Lbp-R1作为首选靶点。

表1 针对Lbp基因的sgRNA靶点名称及序列Table 1 Namesandsequencesoflipopolysaccaridebinding protein(Lbp)gene-small guide RNA(gRNA)target

2.2 Lbp基因敲除鼠的鉴定

显微注射后，共获得65 枚生长活性较好的受精卵，将这些受精卵移植到2只假孕的ICR雌鼠中，分娩后共获得17只F0代小鼠，基因组鉴定及测序显示脚趾编号为3、8、10、12、15的小鼠为阳性杂合子鼠（图2A、B），阳性率为22.73%。因F0代3号小鼠770 bp左右目的条带较为清晰，测序显示单链缺失1 457 bp，故将F0 代3 号小鼠与WT 的C57BL/6 小鼠交配，共获得6只F1代，基因组鉴定及测序表明3只小鼠为Lbp+/-。

图2 F0代及F2代Lbp基因敲除小鼠的基因型鉴定结果Figure 2 Genotyping results of F0 and F2 lipopolysaccaride binding protein（Lbp）gene knockout mice

F1 代Lbp+/-鼠间自交共获得12 只F2 代鼠，基因组鉴定及测序表明4 只小鼠为Lbp-/-，5 只为Lbp+/-，3 只为WT。F3 代共获得122 只小鼠，其中Lbp-/-30 只（14♀+16♂）、Lbp+/-61 只（32♀+29♂）、WT 31 只（14♀+17♂），分别占F3 代总数的24.59%、50.00%和25.41%，约为1∶2∶1，符合孟德尔遗传定律且性别比例约为1∶1。

2.3 F2代Lbp基因敲除鼠的mRNA和蛋白鉴定

由Lbp-/-小鼠肝脏组织中mRNA 的RT-PCR 测序结果可知，Lbp-/-mRNA 缺失244 bp，符合设计目的（图3A、B）。序列剪切后mRNA 发生移码突变，拼接成新的mRNA，新序列在剪切位点后第29位（图4B划框位置）对应LBP 的第71 位氨基酸处引入翻译终止信号，导致翻译提前终止，从而无法进行正常翻译。

蛋白质印迹实验结果如图3C 所示，提示Lbp-/-小鼠肝脏不表达LBP。

图3 RT-PCR测序和蛋白质印迹法分别检测Lbp基因敲除鼠的mRNA转录及蛋白表达情况Figure 3 The expression of mRNA and protein in liver tissues of Lbp gene knockout mice detected by RT-PCR sequencing and Western blotting

2.4 Lbp基因敲除鼠的表型分析

观察F0、F1、F2、F3 代Lbp-/-、Lbp+/-小鼠的表型发现，与WT相比，其体质量、毛色、窝产仔鼠数量、对外界刺激的反应大小、自发活动等均无明显差异。后续腹腔注射不同剂量（10、20、50、100、150 μL）、质量浓度为1 mg/mL 的LPS，观察不同时间段Lbp-/-、Lbp+/-及WT小鼠的表型，发现WT小鼠随注射剂量的增加，冷颤、发抖、腹泻、眼分泌黏液、行动迟缓等症状加重，甚至出现死亡的现象（150 μL 剂量84 h 死亡）；相同条件下Lbp-/-小鼠的症状明显轻于WT 和Lbp+/-小鼠，且没有出现死亡现象。

3 讨论

LPS 作为一种促炎因子及免疫分子，可以刺激机体发生相应的免疫反应，在天然免疫反应中发挥着重要的作用。但过高的LPS 会对机体产生不同程度的伤害，导致机体炎性因子过度释放，严重时可引起多器官功能衰竭、败血症休克等，危及生命［10-11］。LBP的作用主要与炎性反应有关，其在发挥作用时对炎性反应有两方面的影响［12-13］：一是当LPS与LBP 的炎性位点结合时，引起相关转录因子及炎性介质产生，从而起到促炎作用；二是当LPS 结合LBP 的抗炎部位时，它向靶细胞传递信号，中和或消除LPS，阻止LPS发挥作用，从而起到抗炎作用［14］。Lbp-/-小鼠在多种实验研究中均有重要作用，如：Won等［15］以BALB/cLbp-/-小鼠为背景，讨论了低炎性反应下与骨关节炎相关的致病介质；Molinaro 等［16］以MyD88 敲除小鼠为背景，探讨了LBP 的表达对小鼠葡萄糖稳态的影响；宋子晨［17］将SD 大鼠的Lbp基因敲除，研究了LPS 对肝脏线粒体的损害及作用机制。然而，在LBP 这些相关研究中，以C57BL/6JLbp-/-小鼠为背景的相关报告较少。LBP 与LPS 结合的具体作用机制虽有研究，但造成炎性反应的因素较为复杂，LBP 在抗菌、抗炎等方面的作用机制需要进一步揭示［18-20］。

Lbp基因有5 个转录产物，其中Lbp-201、Lbp-202、Lbp-203 可翻译为蛋白质，Lbp-202 的序列为1～123 aa，Lbp-203 的序列起始位点为194 aa。本次实验在设计靶点时考虑到这3 个序列的差异，因此选择对Lbp-201的序列进行剪切，剪切位点位于功能保守区的N 端（42～123 aa），剪切后导致Lbp-201、Lbp-202、Lbp-203 均无法正常翻译，从而达到LBP 失活的目的。本次实验利用CRISPR/Cas9技术构建Lbp敲除小鼠，通过PCR 鉴定及测序验证，F0 代共获得5 只Lbp+/-小鼠，F1 代3 只Lbp+/-，F2 代4 只Lbp-/-、5 只Lbp+/-，F3 代30只Lbp-/-、61 只Lbp+/-。F2 代Lbp-/-DNA 测序结果显示，1 457 bp 缺失符合预期，其RNA 测序结果显示244 bp缺失符合预期。

蛋白质印迹实验结果表明，Lbp-/-小鼠肝脏中LBP不表达，F3代各小鼠基因型和性别数值显示，本次构建获得的Lbp敲除小鼠能够稳定遗传，且符合孟德尔遗传规律。杂合子小鼠继续繁育，即可获得大量可用于后续实验的纯合子敲除鼠。正常情况下Lbp-/-的表型与WT 没有显著差异，但注射LPS 后WT 小鼠的炎性反应显著大于Lbp-/-，由此猜测Lbp-/-虽无法正常表达LBP，但仍会将LPS信号传递给靶细胞，引起机体出现冷颤、发抖等炎性反应，但是此传递过程缓慢，引起的炎性反应程度轻。

综上，本实验利用CRISPR/Cas9 技术成功构建了以C57BL/6J为背景的Lbp-/-小鼠，为进一步探索LBP对C57BL/6J 小鼠肠道菌群的影响，研究LBP 缺失前后LPS对肝、肾等组织免疫调节的影响提供了基础。

[医学伦理声明Medical Ethics Statement]

本研究中动物实验遵循3R 原则，已获得山东省实验动物中心伦理批准（20181224-01）。所有实验过程均遵照实验动物相关法律法规条例要求进行。

The animal experiments involved in this study were carried out in accordance with the principle of 3Rs, and had obtained the ethical approval of Shandong Laboratory Animal Center (No. 20181224-01). All experiment protocols were carried out following the relevant laws and regulations on Laboratory animals.

[作者贡献Author Contribution]

李思迪负责论文撰写及实验实施；付彬、郭中坤负责论文撰写及实验实施指导；林颖杰负责论文实验操作指导；张振宇、米传靓负责论文相关实验操作；王可洲负责实验实施指导、论文撰写及修改指导。

[利益声明Declaration of Interest]

本文所有作者均声明本文不存在利益冲突。