不同炮制方法的巴戟天寡糖对骨质疏松模型雄性小鼠氧化应激和股骨组织形态的影响

庄文德，钟 诚，陈浩谚，王东平，郭浩华，丁 平，晋大祥，谢炜星*

不同炮制方法的巴戟天寡糖对骨质疏松模型雄性小鼠氧化应激和股骨组织形态的影响

庄文德1，钟 诚1，陈浩谚2，王东平1，郭浩华1，丁 平3，晋大祥4，谢炜星4*

1. 广州中医药大学第一临床医学院，广东 广州 510006 2. 华南理工大学材料科学与工程学院，广东 广州 511400 3. 广州中医药大学中药学院，广东 广州 510006 4. 广州中医药大学第一附属医院脊柱骨科，广东 广州 510405

探讨巴戟天寡糖对环磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）诱导骨质疏松雄性小鼠氧化应激指标和股骨组织形态的影响，并探析炮制工艺对巴戟天寡糖成分及效用的影响。对巴戟天寡糖及酒巴戟天寡糖中成分进行提取分离并验证。将雄性昆明小鼠随机分为对照组、模型组、维生素D3（5 μg/kg）组及巴戟天寡糖低、高剂量（50、200 mg/kg）组和酒巴戟天寡糖低、高剂量（50、200 mg/kg）组。除对照组外，其余小鼠连续15 d ig CTX（4.5 mg/kg）制备骨质疏松模型，造模结束后，给予相应药物干预4周，测定各组小鼠血清中谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、过氧化氢酶（catalase，CAT）活性和丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平；采用Micro-CT对股骨远端骨微结构进行分析；采用三点弯曲法测定骨生物力学参数；制片测量骨组织形态计量学参数。巴戟天寡糖及酒巴戟天寡糖的6种寡糖成分的含量不同，巴戟天寡糖中-果糖、蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖的含量较酒巴戟天寡糖更多，而酒巴戟天寡糖中(+)-无水葡萄糖的含量更多。与模型组相比，巴戟天寡糖低剂量组小鼠股骨的骨密度显著增加（＜0.01）；骨生物力学参数改善（＜0.05、0.01）；血清MDA水平降低（＜0.05）；松质骨的骨小梁面积比（percentage of trabecular bone area，Tb.Ar）、荧光标记周长比（percentage of fluorescent label perimeter，L.Pm）、骨矿化沉积率（mineral apposition rate，MAR）及骨形成率（bone formation rate to bone volume，BFR/BV）显著升高（＜0.05、0.01），骨小梁分离度（trabecular separation，Tb.Sp）和破骨细胞数目（number of osteoclast，OC.N）显著降低（＜0.01）；皮质骨的MAR显著降低（＜0.05），BFR/BV显著升高（＜0.01）。巴戟天寡糖高剂量组小鼠骨密度显著增加（＜0.01）；血清中CAT活性显著升高（＜0.01）；松质骨组织中Tb.Ar显著升高（＜0.05），Tb.Sp显著降低（＜0.05）。酒巴戟天寡糖低剂量组小鼠骨密度显著增加（＜0.01）；骨生物力学参数改善（＜0.05）；血清GSH-Px活性升高（＜0.01）；松质骨的Tb.Ar、L.Pm、MAR及BFR/BV显著升高（＜0.05、0.01），Tb.Sp和OC.N显著降低（＜0.05、0.01）；皮质骨的MAR显著降低（＜0.05），BFR/BV显著升高（＜0.05）。酒巴戟天寡糖高剂量组小鼠血清中CAT活性显著升高（＜0.01），对于骨结构改变则无明显影响作用。不同炮制工艺会影响巴戟天寡糖的成分含量。巴戟天寡糖及酒巴戟天寡糖均能不同程度地改善氧化应激指标，但低剂量的巴戟天寡糖及酒巴戟天寡糖对于改善CTX引起的骨质疏松的作用更为显著。

巴戟天寡糖；酒炙；-果糖；蔗糖；1-蔗果三糖；耐斯糖；1F-果呋喃糖基耐斯糖；(+)-无水葡萄糖；氧化应激；骨质疏松

随着老年化社会的来临，男性骨质疏松症（osteoporosis，OP）的发病率也逐年升高。据报道，50岁以上的群体中男性OP患病率为6.0%，需要进行防治的低骨量男性群体患病率高达46.9%[1]，而且伴随年龄的增加，男性OP患者意外骨折后死亡率更高[2]，具有高危害性。现代研究表明人体衰老的发生发展与机体氧化应激水平紧密联系[3]，而氧化应激是导致OP发病一大原因[4]。目前批准用于治疗男性OP药物主要是双膦酸盐类、活性维生素D制剂以及降钙素类药物，长期使用会出现不良反应，治疗手段较局限[5-6]。根据《黄帝内经·素问》理论，人体的衰老、OP的发病均与肾阳虚衰有密切联系。巴戟天How具有补肾阳、壮筋骨、祛风湿的功效。现代药理学研究发现，巴戟天具有抗骨质疏松、抗炎、镇痛、抗衰老、抗氧化等多种生物活性，而且酒炙炮制后，其效应会发生改变。此外，巴戟天寡糖作为巴戟天主要的药效成分，其质量分数可占药材干质量的10%以上[7-12]。基于此，本研究通过以巴戟天寡糖及酒制巴戟天寡糖干预环磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）致OP雄性小鼠，考察其氧化应激指标及股骨骨密度、骨微结构变化，探究巴戟天寡糖抗OP作用及炮制工艺对巴戟天寡糖效应的影响，以期为研究男性OP的治疗及巴戟天寡糖的进一步开发及临床应用提供科学依据。

1 材料

1.1 动物

SPF级雄性昆明小鼠，体质量（20±2）g，4周龄，购自广州中医药大学实验动物中心，生产许可证号SYXK（粤）2018-0085。动物饲养于室温20～25 ℃、湿度40%～60%的环境中，室内照明以自然采光为主，通风良好，环境较安静。动物实验符合广州中医药大学实验动物伦理委员会规定，均符合3R原则。

1.2 药品与试剂

注射用CTX（批号9F312A）购自Baxter Oncology GmbH公司；维生素D3滴剂（批号20180401-1）购自杭州海王生物工程有限公司；巴戟天寡糖及酒巴戟天寡糖由广州中医药大学中药学院丁平教授提供；谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）试剂盒（批号20191209）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒（批号20191218）、过氧化氢酶（catalase，CAT）可见光试剂盒（批号20191214）均购自南京建成生物工程研究所。

1.3 仪器

Primaide高效液相色谱仪（日本日立高新技术公司）；UM5800型蒸发光散射检测器（上海通微分析技术有限公司）；XR 205SM-DR型电子分析天平（瑞士Precisa公司）；DFT-200型高速万能粉碎机（温岭市林大机械有限公司）；CQ-200型超声波清洗器（上海音波声电科技公司）；Eclipse TE2000-5型倒置荧光显微镜（日本尼康公司）；BC-2800Vet型全自动动物血液细胞分析仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）；1510型全波长酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；CT14RD型低速冷冻离心机（天美科学仪器有限公司）；移液枪（德国Eppendorf公司）；SkyScan 1276 Micro-CT扫描仪（美国Bruker公司）。

2 方法

2.1 巴戟天寡糖及酒巴戟天寡糖中成分的验证

2.1.1 样品制备 分别取巴戟天寡糖、酒巴戟天寡糖各0.1 g，加入60%乙腈溶解并定容至10 mL，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜，即得。

2.1.2 色谱条件 Waters XBridgeTM Amide色谱柱（250 mm×4.6 mm，3.5 μm），流动相为0.2%三乙胺乙腈（A）-0.2%三乙胺水溶液（B），梯度洗脱：0～10 min，75%～70% A；10～20 min，70% A；20～45 min，70%～60% A；45～60 min，60% A；60～63 min，60%～75% A；63～75 min，75% A。体积流量为0.8 mL/min；进样量为20 μL；蒸发光散射检测器（ELSD）漂移管温度为75 ℃；氮气体积流量为2.0 L/min；柱温为35 ℃。

2.2 动物分组、造模及给药

动物适应性饲养1周后，随机分为对照组、模型组、维生素D3（5 μg/kg）组及巴戟天寡糖低、高剂量（50、200 mg/kg）组和酒巴戟天寡糖低、高剂量（50、200 mg/kg）组，每组13只。除对照组外，其余各组小鼠ig CTX（4.5 mg/kg）制备OP模型[13]，对照组ig等体积的生理盐水，1次/d，连续15 d。造模结束后，各给药组ig相应药物，对照组和模型组ig等体积生理盐水，1次/d，连续4周。观察各组小鼠的运动状态、精神状态、毛发外观等变化。

2.3 各组小鼠血清中GSH-Px、CAT活性及MDA水平的检测

给药4周后，小鼠ip戊巴比妥钠（1 mL/kg）后进行腹主动脉采血，全血于室温放置，分层后3500 r/min离心10 min，取上层血清，按试剂盒说明书测定血清中GSH-Px、CAT活性及MDA水平。

2.4 各组小鼠股骨Micro-CT检测

给药结束后，小鼠ip戊巴比妥钠（1 mL/kg）安乐死，逐层分离骨组织肌肉，取右侧股骨行Micro-CT连续扫描，扫描参数：电流100 μA；电压80 kV；扫描厚度15 μm；滤片0.5 mm；扫描方向沿股骨长轴扫描股骨远端，最终获取连续平面Micro-CT图像。扫描完成后在主机上选出股骨远端1.5 mm的区域为感兴趣区域（range of interests，ROI），在配套软件上分析骨密度。

2.5 各组小鼠股骨生物力学性能的测定

用游标卡尺测量小鼠股骨的长度、短轴宽度和长轴宽度，用万能材料试验机进行三点弯曲试验，测定骨骼的最大载荷、最大挠度、最大应力、最大应变和能量吸收值。

2.6 各组小鼠松质骨及皮质骨形态计量学分析

取各组小鼠松质骨及皮质骨，制备不脱钙骨组织塑料切片，并对组织切片进行测量，进行骨组织形态计量学分析。分别测量并计算骨小梁面积比（percentage of trabecular bone area，Tb.Ar）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨小梁数量（trabecular number，Tb.N）、骨小梁分离度（trabecular separation，Tb.Sp）、皮质骨面积比（percentage of cortical bone area，Ct.Ar）、骨髓腔面积比（percentage of marrow-cavity area，Ma.Ar）、荧光标记周长比（percentage of fluorescent label perimeter，L.Pm）、骨矿化沉积率（mineral apposition rate，MAR）、骨形成率（bone formation rate to bone volume，BFR/BV）和破骨细胞数目（number of osteoclast，OC.N）等参数。

2.7 统计学分析

3 结果

3.1 巴戟天寡糖和酒巴戟天寡糖的成分分析

如图1和表1所示，巴戟天寡糖及酒巴戟天寡糖中6种寡糖的含量不同，巴戟天寡糖中-果糖、蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖的含量较酒巴戟天寡糖更多，而酒巴戟天寡糖中(+)-无水葡萄糖的含量更多。

3.2 动物行为学观察

与对照组比较，模型组小鼠毛发稀疏干枯，懒动思卧，精神状态欠佳。与模型组比较，各给药组小鼠精神状态好转，毛发较光亮。对照组小鼠无死亡，模型组死亡2只，维生素D3组死亡1只，巴戟天寡糖低剂量组死亡2只，巴戟天寡糖高剂量组无死亡，酒巴戟天寡糖低剂量组无死亡，酒巴戟天寡糖高剂量组死亡3只。

1-D-果糖 2-D(+)-无水葡萄糖 3-蔗糖 4-1-蔗果三糖 5-耐斯糖 6-1F-果呋喃糖基耐斯糖

表1 巴戟天寡糖及酒巴戟天寡糖中6种寡糖成分

Table 1 Six oligosaccharides in M. officinalis oligosaccharides and wine M. officinalis oligosaccharides

组别质量分数/(mg·g−1) D-果糖D(+)-无水葡萄糖蔗糖1-蔗果三糖耐斯糖1F-果呋喃糖基耐斯糖 巴戟天寡糖62.0206.39573.93064.869100.854148.458 酒巴戟天寡糖56.22925.09767.92239.45088.319141.863

3.3 巴戟天寡糖和酒巴戟天寡糖对OP小鼠血清中GSH-Px、CAT活性及MDA水平的影响

如表2所示，与对照组比较，模型组小鼠血清中GSH-Px和CAT活性均显著降低（＜0.05、0.01），MDA水平显著升高（＜0.05）；与模型组比较，维生素D3组小鼠血清中GSH-Px和CAT活性均显著升高（＜0.05），MDA水平显著降低（＜0.05）；巴戟天寡糖低剂量组小鼠血清中MDA水平显著降低（＜0.05）；巴戟天寡糖高剂量组小鼠血清中CAT活性显著升高（＜0.01）；酒巴戟天寡糖低剂量组小鼠血清中GSH-Px活性显著升高（＜0.01）；酒巴戟天寡糖高剂量组小鼠血清中CAT活性显著升高（＜0.01）。

表2 巴戟天寡糖和酒巴戟天寡糖对OP小鼠血清中GSH-Px、CAT活性及MDA水平的影响()

Table 2 Effect of M. officinalis oligosaccharides and wine M. officinalis oligosaccharides on GSH-Px, CAT activities and MDA level in serum of OP mice ()

组别剂量/(mg·kg−1)n/只GSH-Px/(μmol·L−1)CAT/(U·mL−1)MDA/(nmol·mL−1) 对照—13629.05±92.997.89±1.954.31±2.32 模型—11553.54±68.21#3.38±0.64##7.84±4.79# 维生素D3—12658.01±50.99*7.38±0.75*4.03±2.56* 巴戟天寡糖5011610.29±72.195.49±2.255.69±2.26* 20013604.98±58.337.37±2.44**6.16±2.88 酒巴戟天寡糖5013707.23±97.83**6.31±2.757.28±1.87 20010563.70±126.208.57±1.88**6.80±2.18

与对照组比较：#＜0.05##＜0.01；与模型组比较：*＜0.05**＜0.01，下表同

#< 0.05##< 0.01control group;*< 0.05**< 0.01model group, same as below tables

3.4 巴戟天寡糖和酒巴戟天寡糖对OP小鼠股骨微结构的影响

如图2所示，与对照组比较，模型组小鼠皮质骨变薄，骨髓腔增大，骨小梁网状结构退化，呈现出明显的骨微结构破坏。与模型组比较，各给药组小鼠皮质骨面积增加，骨髓腔缩小，骨小梁数量、宽度、长度、形态部分恢复，密度和网状结构联结性增加。其中，巴戟天寡糖低剂量组和酒巴戟天寡糖低剂量组基本达到对照组水平，与维生素D3组基本一致。

图2 各组小鼠股骨远端Micro-CT X-Y三维剖面图

3.5 巴戟天寡糖和酒巴戟天寡糖对OP小鼠股骨骨密度的影响

如表3所示，与对照组比较，模型组小鼠股骨骨密度显著降低（＜0.01）；与模型组比较，除酒巴戟天寡糖高剂量组外，其余各给药组小鼠股骨骨密度均显著升高（＜0.01）。

表3 巴戟天寡糖和酒巴戟天寡糖对OP小鼠股骨骨密度的影响()

Table 3 Effect of M. officinalis oligosaccharides and wine M. officinalis oligosaccharides on femoral bone density of OP mice ()

组别剂量/(mg·kg−1)n/只骨密度/(g·cm−2) 对照—130.098±0.009 模型—110.054±0.005## 维生素D3—120.076±0.005** 巴戟天寡糖50110.097±0.013** 200130.081±0.010** 酒巴戟天寡糖50130.093±0.018** 200100.056±0.018

3.6 巴戟天寡糖和酒巴戟天寡糖对OP小鼠股骨生物力学性能的影响

如表4所示，与对照组比较，模型组小鼠股骨的最大载荷、最大应力及最大应变均显著降低（＜0.05、0.01）；与模型组相比，维生素D3组、巴戟天寡糖低剂量组和酒巴戟天寡糖低剂量组小鼠股骨的最大应力及最大应变均显著升高（＜0.05、0.01）；巴戟天寡糖低剂量组小鼠股骨的最大载荷显著升高（＜0.05）。

3.7 巴戟天寡糖和酒巴戟天寡糖对OP小鼠股骨形态计量学参数的影响

如表5所示，与对照组比较，模型组小鼠松质骨组织中Tb.Th无显著变化，但Tb.Ar、Tb.N、L.Pm、MAR和BFR/BV均显著降低（＜0.01），Tb.Sp和OC.N显著增加（＜0.01）；与模型组比较，维生素D3组、巴戟天寡糖低剂量组和酒巴戟天寡糖低剂量组小鼠松质骨组织中Tb.Ar、L.Pm、MAR、BFR/BV显著升高（＜0.05、0.01），Tb.Sp和OC.N显著降低（＜0.05、0.01）；巴戟天寡糖高剂量组小鼠松质骨组织中Tb.Ar显著升高（＜0.05），Tb.Sp显著降低（＜0.05）。

表4 巴戟天寡糖和酒巴戟天寡糖对OP小鼠股骨生物力学性能的影响()

Table 4 Effect of M. officinalis oligosaccharides and wine M. officinalis oligosaccharides on biomechanical properties of femurs in OP mice ()

组别剂量/(mg·kg−1)n/只最大载荷/N最大挠度/mm最大应力/MPa最大应变/%能量吸收值/J 对照—13135.5±20.21.05±0.46103.5±26.14.52±0.650.075±0.018 模型—1199.5±15.3#0.93±0.1283.0±18.5#2.23±0.23##0.058±0.012 维生素D3—12113.2±17.51.03±0.38102.5±16.7*4.32±0.31**0.065±0.015 巴戟天寡糖5011123.9±19.3*1.04±0.44101.8±14.9*4.21±0.32**0.064±0.017 20013110.3±14.80.94±0.1694.6±0.02.51±0.260.059±0.016 酒巴戟天寡糖5013116.8±16.71.00±0.33102.8±14.9*3.94±0.37*0.064±0.011 20010101.6±13.60.82±0.1586.7±20.12.66±0.940.060±0.012

表5 各组小鼠松质骨静态和动态参数的变化()

Table 5 Changes of static and dynamic parameters in cancellous bone of mice in each group ()

组别剂量/(mg·kg−1)n/只 Tb.Ar/%Tb.Th/μmTb.N/mm−1Tb.Sp/μmL.Pm/%MAR/(μm·d−1)BFR/BV/%OC.N/mm2 对照—13 20.5±7.352.5±12.33.1±0.9286.4±28.518.0±5.48.5±0.2276.2±35.64.0±1.5 模型—11 5.5±1.2##49.6±15.60.9±0.1##470.9±63.6##9.5±3.6##4.5±0.1##123.1±20.5##19.5±3.6## 维生素D3—12 8.6±1.3*50.6±11.31.0±0.3305.8±31.4**15.2±3.7*6.5±0.3*256.8±10.3**10.2±2.0** 巴戟天寡糖5011 10.5±2.3**52.5±18.21.0±0.4310.3±32.1**16.3±5.5*6.3±0.2*256.5±20.6**10.0±1.9** 20013 9.5±1.6*48.5±14.60.9±0.1350.1±37.6*10.1±4.84.7±0.1166.5±20.418.3±1.3 酒巴戟天寡糖5013 11.5±2.4**53.6±16.41.0±0.3365.7±26.1*16.2±5.5*6.4±0.2*242.9±31.3**11.7±2.6** 20010 5.9±1.449.7±12.40.8±0.1471.0±94.510.7±2.54.6±0.2155.9±29.217.0±2.3

如表6所示，与对照组比较，模型组小鼠皮质骨中Ct.Ar、L.Pm、MAR及BFR/BV均显著降低（＜0.05、0.01），Ma.Ar显著增加（＜0.01），提示CTX诱导雄性小鼠皮质骨变薄，骨量丢失，生成速度减慢。与模型组比较，维生素D3组、巴戟天寡糖低剂量组和酒巴戟天寡糖低剂量组小鼠皮质骨组织中Ma.Ar显著降低（＜0.05），BFR/BV显著升高（＜0.05、0.01）。

表6 各组小鼠皮质骨静态和动态参数的变化()

Table 6 Changes of static and dynamic parameters in cortical bone of mice in each group ()

组别剂量/(mg·kg−1)n/只Ct.Ar/%Ma.Ar/%L.Pm/%MAR/(μm·d−1)BFR/BV/% 对照—1370.5±7.320.6±4.333.5±3.64.4±0.573.1±10.5 模型—1155.5±11.4#29.6±5.6##25.2±5.4#2.8±0.1#56.4±5.6## 维生素D3—1256.8±8.323.6±5.3*26.0±3.03.1±0.364.8±5.3* 巴戟天寡糖501156.5±9.323.5±4.2*26.3±5.23.1±0.269.5±4.2** 2001359.5±8.628.5±4.625.1±4.72.9±0.156.5±6.2 酒巴戟天寡糖501357.5±10.424.6±6.4*27.3±3.33.0±0.262.9±4.6* 2001058.4±8.429.7±2.426.7±2.62.4±0.254.9±6.3

4 讨论

《素问·上古天真论》曾言“丈夫······六八阳气衰竭于上，面焦，发鬓颁白。七八肝气衰，筋不能动。八八天癸竭，精少，肾脏衰，形体皆极，则齿发去”。男性在生长发育以及衰老过程中需要耗损大量阳气，其中又以肾阳耗损最重[14]。《素问·阴阳别论篇》中云：“阳气虚，则为偏枯。阳虚而不能养筋，则为痿”。肾阳虚衰，无以温煦濡养筋脉骨骼，甚则骨枯髓减，进展为“骨痿”。由此可见，运用补肾阳法干预男性OP的发病及进展具有中医理论上的依据。

现代研究表明，机体进入衰老状态后，骨微环境中增多的促炎性分泌蛋白会导致OP的发生[15]，而衰老是细胞内成分累积性氧化损伤的结果，因此机体抗氧化系统对于延缓衰老及防治OP至关重要[16]。既往研究发现CTX具有生殖毒性、骨质疏松等不良反应，不少研究者利用CTX构建与衰老、骨质疏松、组织高氧化应激状态等相关小鼠模型[12,17]。因此，本研究利用CTX干预雄性昆明小鼠构建OP模型，发现模型小鼠具有骨密度下降、骨量严重丢失、骨微结构破坏、氧化应激指标升高等特点，可用于模拟男性OP机体状态。

有学者发现临床上运用补肾阳法治疗男性OP患者，能够有效改善骨密度及骨代谢指标[18]，但其具体机制尚不明确。目前，大量研究表明肉苁蓉、淫羊藿、杜仲等补肾阳中药能够提高雄性实验鼠体内组织中GSH-Px活性，降低MDA水平，延缓或逆转其组织的氧化损伤，还能够提高骨骼质量、骨密度，改善骨小梁结构等[19-24]，更进一步地揭示了男性OP的发病与氧化应激具有一定联系，但目前从氧化应激角度探讨男性OP的发病及治疗的研究仍相对较少。因此，本研究使用巴戟天寡糖干预CTX致OP的雄性小鼠，发现其可以有效改善实验小鼠的骨密度、持续骨丢失及骨微结构破坏的现象，同时调节血清中GSH-Px、CAT活性及MDA水平。本研究还发现与维生素D3相比，巴戟天寡糖在改善骨密度上效果更明显，在改善其余OP及氧化应激指标上则作用相近，表明巴戟天寡糖具有较好的抗OP及改善氧化应激作用，而且可能通过调节雄性实验鼠体内氧化应激发挥抗OP作用，但这仍需进一步实验证实。

研究发现，炮制后的巴戟天化学成分与作用效果发生改变，巴戟天酒炙后在机体能量代谢上具有与盐炙相似的炮制增效作用，且作用较盐炙更优；巴戟天酒炙后寡糖对生精障碍雄性小鼠生殖氧化应激作用明显优于生巴戟天寡糖[12,25-26]。本研究发现巴戟天寡糖与酒巴戟天寡糖在6种寡糖成分的含量上均有不同，巴戟天寡糖中-果糖、蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖的含量较酒巴戟天寡糖更多，而酒巴戟天寡糖中(+)-无水葡萄糖的含量更多。

本研究结果显示，巴戟天寡糖及酒巴戟天寡糖均有较好的抗OP及改善氧化应激作用，但巴戟天寡糖改善血清MDA水平更显著，酒巴戟天寡糖在改善GSH-Px指标上更为明显。低剂量的巴戟天寡糖和酒巴戟天寡糖能够升高CTX致OP小鼠松质骨的Tb.Ar、L.Pm、MAR和BFR/BV，显著降低Tb.Sp和OC.N，一定程度上恢复变薄的皮质骨，减少皮质骨量丢失，增加皮质骨生成速度，与维生素D3作用相近，具有较好的抗OP作用。这可能是巴戟天寡糖调控骨保护素/核因子κB受体活化因子配体/核因子κB受体活化因子（osteoprotegerin/ receptor activator of nuclear factor-κB/receptor activator of nuclear factor κB ligand，OPG/RANK/ RANKL）通路从而发挥抗OP的作用[27]，但炮制后巴戟天寡糖的寡糖成分含量发生改变和剂量的不同，也影响其效用发挥，目前相关研究较少，其潜在机制尚不明确，这也提示可以进一步探讨巴戟天寡糖中不同寡糖成分的作用及效应机制，以明确巴戟天抗骨质疏松的有效成分及具体机制。

目前，临床上尚无针对男性OP的专门用药，且许多含有补肾阳药的抗OP药物服用周期往往较长，一般为3～6个月，患者容易出现口干、便秘、面红等不良反应，无法长期服用[28]。同时，中药饮片质量良莠不齐，便携性差，也影响了其推广与使用[29]。巴戟天寡糖具有低热、稳定、安全无毒等良好理化性质，并且已有中成药制剂应用于临床[30]，在抗OP方面具有较好的应用前景。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Effect ofoligosaccharides concocted by different methods on oxidative stress and femoral tissue morphology in osteoporotic male mice

ZHUANG Wen-de1, ZHONG Cheng1, CHEN Hao-yan2, WANG Dong-ping1, GUO Hao-hua1, DING Ping3, JIN Da-xiang4, XIE Wei-xing4

1. The First Clinical School, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China 2. School of Materials Science and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 511400, China 3. School of Pharmaceutical Sciences, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China 4. Department of Spinal Surgery, The First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, China

To investigate the effects ofoligosaccharides (MO) on oxidative stress indexes and femoral tissue morphology in male mice with cyclophosphamide (CTX)-induced osteoporosis, and explore the effects of processing technology on the composition and efficacy of MO.The components in MO and wineoligosaccharides (WMO) were extracted, separated and verified. Male Kunming mice were randomly divided into control group, model group, vitamin D3(5 μg/kg) group, MO low-and high-dose (50, 200 mg/kg) groups, WMO low-and high-dose (50, 200 mg/kg) groups. Except for control group, the other mice were continuously ig CTX (4.5 mg/kg) for 15 d to establish osteoporosis models. After the modeling, mice were given corresponding drug for 4-week intervention, glutathione peroxidase (GSH-Px), catalase (CAT) activities and malondialdehyde (MDA) level in serum of mice in each group was measured; Micro-CT was used to analyze distal femur bone microstructure; Three-point bending method was used to determine bone biomechanical parameters; Slices were used to measure bone histomorphometric parameters.MO and WMO had different contents of six kinds of oligosaccharides. Contents of-fructose, sucrose, 1-fructose, nystose and 1F-fructofuranosylnystose in MO was higher than that of WMO, while content of(+)-anhydroglucose was higher in WMO. Compared with model group, bone mineral density of femur of mice in WO low-dose group was significantly increased (< 0.01), bone biomechanical parameters were improved (< 0.05, 0.01), MDA level in serum was decreased (< 0.05); Percentage of trabecular bone area (Tb.Ar), percentage of fluorescent label perimeter (L.Pm), mineral apposition rate (MAR) and bone formation rate to bone volume (BFR/BV) in cancellous bone were significantly increased (< 0.05, 0.01), trabecular separation (Tb.Sp) and number of osteoclasts (OC.N) were significantly decreased (< 0.01); MAR in cortical bone was significantly decreased (< 0.05), and BFR/BV was significantly increased (< 0.01). Bone mineral density of mice in MO high-dose group was significantly increased (< 0.01), CAT activity in serum was significantly increased (< 0.01), Tb.Ar in cancellous bone tissue was significantly increased (< 0.05), Tb.Sp was decreased (< 0.05). Bone mineral density in WMO low-dose group was significantly increased (< 0.01), bone biomechanical parameters were improved (< 0.05), GSH-Px activity in serum was increased (< 0.01); Tb.Ar, L.Pm, MAR and BFR/BV in cancellous bone were significantly increased (< 0.05, 0.01), Tb.Sp and OC.N were significantly decreased (< 0.05, 0.01); MAR in cortical bone was significantly decreased (< 0.05), BFR/BV was significantly increased (< 0.05). CAT activity in serum of mice in WMO high-dose group was significantly increased (< 0.01), but had no significant effect on the changes of bone structure.Different processing techniques can affect the content of MO. MO and WMO can improve oxidative stress indicators to varying degrees, but effect of low dose MO and WMO on improving CTX-induced osteoporosis are more significant.

oligosaccharides; wine process;-fructose; sucrose; 1-fructose; nystose; 1F-fructofuranosylnystose;(+)-anhydroglucose; oxidative stress; osteoporosis

R285.5

A

0253 - 2670(2022)17 - 5409 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.17.017

2022-04-22

国家自然科学基金资助项目（82074007）

庄文德，硕士研究生，研究方向为中医药防治骨质疏松。Tel: 15768884884 E-mail: 20201120142@stu.gzucm.edu.cn

谢炜星，副主任医师，研究方向为脊柱外科及骨质疏松防治。Tel: 13560079199 E-mail: xwx841211@163.com

[责任编辑 李亚楠]