生物纳米孔道单分子多肽磷酸化识别与测量的创新综合实验

胡正利，辛凯莉，刘少创，钟诚兵，武雪原，应佚伦,2，孔璇凤，余晓冬，张剑荣，龙亿涛,＊

1南京大学化学化工学院，生命分析化学国家重点实验室，南京 210023

2南京大学化学和生物医药创新研究院，南京 210023

3南京大学深圳研究院，广东 深圳 518057

实验教学是化学学科培养学生专业学习和实践能力的重要组成部分，有助于学生在提升实验操作技能的同时加深对相关基础理论知识的理解以及科学应用。“科教融合”的教学改革模式注重将前沿科研成果转化为特色教学内容，并融入大学实验教学课堂。科研与教学相辅相成，能够增强学生的学习兴趣和发掘学生的科研潜力，是新时代“推动科研反哺教学”和推进创新型专业人才培养的有效途径[1,2]。单分子科学致力于通过分子个体异质性测量研究在分子层面上揭示生物、化学基本作用原理和反应机制，已逐渐发展成为生物、化学等学科领域的热点前沿[3-7]。然而，目前国内分析化学实验教学内容多为针对大量分子群体行为的测量，很少涉及单分子实验技术。因此，填补单分子技术在本科实验教学上的空白，具有重要的教学意义。目前，单分子测量技术引入实验教学的主要困难在于缺少成本低、便携式的教学仪器设备以及适配的教学方案。

生物纳米孔道技术是一种利用单分子电流信号的差异进行待测物区分和分子间相互作用研究的单分子分析方法，具有操作简单、高灵敏、高分辨、无需标记等优势，被认为是最具潜力的第三代单分子测序技术之一[8,9]。1996年，α-溶血素(α-Hemolysin)生物纳米孔道被用于DNA单分子检测[10]，自此以来，生物纳米孔道技术已经在核酸测序[11]、DNA损伤检测[12,13]、蛋白质测序[14-17]与构象解析[18-20]以及单分子反应监测[21-24]等方面取得了重要进展。经过不断优化迭代，便携式电化学微弱电流测量仪器及配套的数据软件性能也日益完善，确保了本实验能够在有限的教学空间和教学时间内顺利完成。例如，笔者课题组自主研发了Cube电化学测量仪器及SmartNanopore系列数据记录软件[25-28]，仪器主要包括集成化信号处理主机以及装配有前置电流放大器探头的法拉第屏蔽箱，两者尺寸分别仅为12 cm × 12 cm × 8 cm和7.5 cm × 5.5 cm × 12.5 cm，法拉第屏蔽箱可极大地消除周围环境的电磁噪音干扰，使其能够在常规实验教室进行纳米孔道实验教学；自主开发了PyNanoLab数据处理软件(https://www.pynanolab.com/)，能够实现从原始数据导入到结果图表绘制的全过程、快速处理分析，大大缩短了纳米孔道实验教学所需的时间，可以充分满足实验教学需求。因此，笔者团队在多年从事纳米孔道单分子研究的基础上，设计了利用生物纳米孔道电化学技术测量单个生物分子的综合化学实验，主要包括课前基础知识讲解、仪器和实验培训、学生自主实验以及头脑风暴环节四部分内容，旨在以兴趣为导向，激励学生主动学习、自由讨论和自主创新。该实验以气单胞菌溶素(Aerolysin)生物纳米孔道检测单个生物分子为实验范例，于2019年依托南京大学化学实验教学中心开设试行，并根据教学实践不断改进和完善，获得了良好的教学效果[29]。由于单分子检测灵敏度和分辨率主要取决于生物纳米孔道测量界面的物理化学性质[30-35]，本实验选择使用突变型T232K/K238Q Aerolysin生物纳米孔道检测多肽磷酸化，模型分子是Tau蛋白微管结合区域的多肽片段，Tau蛋白磷酸化与多种神经退行性疾病(如阿尔兹海默症)相关。随着纳米孔道单分子DNA测序的基本实现，近年来，准确还原蛋白质“原貌”，实现多肽/蛋白质测序及其翻译后修饰检测逐渐成为生物纳米孔道研究热点，但是要真正达到实际应用的目的仍有诸多问题需要解决[36,37]。因此，本实验兼具综合性和前沿性，能够很好地展现纳米孔道单分子技术和前沿科学研究的魅力，较好地达到培养学生的科研兴趣、团队合作和科学素养的教学目的。

1 实验目的

(1) 了解纳米孔道电化学单分子检测的原理和方法；

(2) 掌握磷脂双分子层和蛋白纳米孔道的制备技术；

(3) 熟悉微弱电化学信号测量系统的使用要点；

(4) 熟悉单分子微弱电流信号的数据处理；

(5) 通过单分子多肽磷酸化检测研究，培养学生的科研思维和解决问题的能力。

2 实验原理

本实验采用的生物纳米孔道技术是一种通过解析单个分子引起的孔道内离子电流的特征性变化，在单分子水平上获取待测物信息的检测方法。如图1所示，该方法的关键步骤是在垂直伸展的双分子层磷脂膜上自组装形成单个Aerolysin生物纳米孔道，该孔道作为唯一通道执行孔道两侧溶液中的分子离子转运[38,39]。实验时，需要在检测池两个腔室内分别灌注500 μL的1.0 mol·L−1的Tris-KCl溶液，随后加入待测多肽，在电压驱动下多肽分子逐一通过单个Aerolysin纳米孔道，改变流经孔道限域空间的离子流，产生皮安培级、(亚)毫秒级的单分子离子电流阻断信号。不同多肽分子由于其电荷、分子量、构象等存在差异，导致其在通过纳米孔道时将产生不同的特征离子电流信号，通过分析这些单分子信号的形状、电流幅值和阻断时间等特征，即可实现单分子多肽的区分。

图1 突变型T232K/K238Q Aerolysin生物纳米孔道检测Tau多肽磷酸化的原理示意图

在测量微弱电流过程中，环境电磁及仪器中存在的噪音会影响电流信号，从而导致较微弱的单分子信号被埋没在噪音中。因此，本实验中选用了课题组研发的Cube 3.0纳米孔道仪器装置，使用法拉第屏蔽箱进行噪音屏蔽、采用电阻反馈式的微弱电流放大系统来记录并采集电流信号。

3 实验试剂和仪器

3.1 实验试剂

1,2-二植烷酰基磷脂(DPhPC)购自Avanti Polar Lipids Inc.试剂公司；正癸烷(无水，≥ 99%)、氯化钾(≥ 99.5%)和胰蛋白酶均购自Sigma-Aldrich试剂公司；乙二胺四乙酸(EDTA，99.995%)、三羟甲基氨基甲烷(Tris，≥ 99.9%)和异丙醇(≥ 99.7%)均购自阿拉丁试剂公司；浓盐酸(36.0%-38.0%)购自国药集团化学试剂有限公司。待测多肽由南京金斯瑞生物科技有限公司合成纯化(图2)，未修饰多肽序列为N’-VQIVYKPVDLS-C’ (Tau306-316)，磷酸化多肽序列为N’-VQIVYKPVDLpS-C’ (pTau306-316)，使用电解液作为溶剂现配现用，浓度为1.0 mmol·L−1。T232K/K238Q Aerolysin蛋白溶液(1.5 μg·mL−1)由笔者课题组制备提供。如没有特殊说明，所有购买试剂均为分析纯并且使用时未经过进一步纯化。实验用超纯水由美国Millipore公司的Milli-Q纯水仪制备得到，所有实验溶液均用超纯水(25 °C时电阻率为18.2 MΩ·cm−1)配制。

图2 多肽质谱表征图

为节约教学时间，本实验需要用到的30 mg·mL−1磷脂正癸烷溶液、1%的正十六烷-正己烷溶液、1.0 mol·L−1Tris-KCl电解质溶液(pH 8.0)均由助教提前准备。本文所有实验均在室温(25 ± 2 °C)条件下完成。

3.2 实验仪器

银/氯化银电极；纳米孔道检测池，由聚四氟乙烯薄膜隔开的两个腔室组成，薄膜中间有一个直径为50 μm左右的圆形微孔；Cube 3.0纳米孔道电化学测量仪器，包括配套的SmartNanopore数据记录软件；PyNanoLab数据处理软件为笔者所在实验室研制。根据教学需要，上述仪器装置笔者课题组均可提供。

4 实验内容

4.1 仪器参数设置

(1) 分别使用音频线连接Cube 3.0仪器主机与电流放大器探头、USB数据线连接Cube 3.0仪器主机与电脑，打开电流放大器探头供电电池开关；

(2) 依次开启Cube 3.0仪器及SmartNanopore软件，单击软件左上角的“Connect to Device (连接设备)”连接仪器与软件，单击软件左上角电池图标连接仪器主机与电流放大器探头(图3)；

图3 Cube仪器装置图与SmartNanopore数据记录软件界面

(3) 设置仪器实验参数，具体如下：Format(模式)为V2，Sampling Rate (采样频率)为100 kHz，Bessel Filter (贝塞尔滤波)为5 kHz，Gain (增益)为−1；

(4) 单击软件面板左上第一个“Conf. (设置)”，依次设置“Rec. Path (数据保存路径)”“File name(文件名称)”并勾选“AutoNum (自动编号)”，如文件名设为211027，该次实验记录的第一个和第二个数据文件会依次自动保存为211027000.dat和211027001.dat；

(5) 单击“Data Acq. (数据获取)”窗口的“Start (开始)”，运行程序。将“Volt. Command (电压命令)”窗口的电压值设为0 mV，单击“auto (自动)”，将电压自动校准至0 mV，可从CH2窗口的右上方实时读取电压值；

(6) 电压校准完成后，在“Data Acq. (数据获取)”窗口，单击“auto (自动)”，将电流自动校准至0 pA，可从CH1窗口的右上方实时读取电流值和RMS值(基线噪音的均方根值)，一般情况下RMS值应小于1 pA。

4.2 磷脂双分子层膜的制备与表征

(1) 使用移液器抽取少量(1.0-2.0 μL)正十六烷-正己烷溶液，移液器吸头贴近检测池的聚四氟乙烯薄膜，将烷烃溶液轻轻旋涂在薄膜两侧微孔附近，随后静置10-15分钟，使正己烷充分挥发；

(2) 检测池放入法拉第屏蔽箱内，分别向池子两个腔室加入500 μL的Tris-KCl电解质溶液，并将一对Ag/AgCl电极的一端分别浸入检测池两侧的电解质溶液中，另一端与放大器探头相连，指定cis端电极接地。此时，检测池两侧的电解质溶液通过薄膜上的微孔连通，软件面板显示电流为溢出状态；

(3) 电压设置为0 mV，分别在检测池两个腔室液面上方附近悬空滴加2.0 μL的磷脂溶液，静置3-5分钟，等待磷脂分子分散平铺在气液界面；

(4) 电压调整为+100 mV，用1 mL注射器缓慢地上下提拉cis或trans腔室中的电解质溶液，磷脂分子在检测池微孔处聚集形成稳定的磷脂双分子层膜，此时电流显示为0 pA；

(5) 调整电压，若在+300 - +400 mV范围内电流溢出，则说明磷脂膜破裂；应立刻重新提拉溶液成膜，在此情况下大多数新成的膜是强度合适的双分子层磷脂膜，可用于进一步实验。

4.3 AeroIysin生物纳米孔道的构建与表征

(1) 电压调整为+200 mV，向薄膜cis侧靠近微孔处的溶液中缓慢加入1.0 µL的T232K/K238Q Aerolysin蛋白溶液，等待3-5分钟，若观察到离子电流突然从0 pA阶跃至约110 pA，表明磷脂膜上自组装形成了单个T232K/K238Q Aerolysin纳米孔道，迅速调整电压为+100 mV以防形成多孔；

(2) 单击“REC. (记录)”，从0 mV到+160 mV以及0 mV到−160 mV，每隔10 mV记录10-15秒数据，再次单击“REC. (记录)”完成记录，用于后续I-V表征孔道；

(3) 电压调整为+100 mV，记录2分钟，同上，分别在+80 mV、+90 mV、+110 mV和+120 mV记录2分钟，用做后续空白对照。

4.4 未修饰与磷酸化Tau多肽的检测识别

(1) 电压调整为+100 mV，向薄膜cis侧溶液中缓慢加入15.0 µL的Tau306-316或pTau306-316多肽溶液，在+80到+120 mV范围内，每隔10 mV分别记录3-5分钟，确保每个电压下单分子事件数量在1000以上；

(2) 电压调整为+100 mV，向薄膜cis侧溶液中缓慢加入15.0 µL的pTau306-316多肽溶液，同上述步骤相同，获得足够的单分子事件；

(3) 结束后，依次关闭软件和断开仪器；

(4) 取出检测池并将溶液转移至专用废液缸，无需拆分，直接依次使用超纯水、异丙醇和超纯水冲洗检测池两个腔室，洗好吹干后置于自封袋内妥善保存；

(5) 参照上述4.1-4.4步骤，重复实验两次。

4.5 纳米孔道单分子多肽数据处理与分析

(1) 读取不同电压下的电流数值，绘制I-V曲线并计算电导，表征纳米孔道的性质；

(2) 打开PyNanoLab软件(图4)，导入原始数据并设置相应参数，自动逐个识别并提取单分子事件的残余电流(Current或I)、阻断电流(ΔI)、残余电流程度(I/I0)、阻断时间(toff或tD)等信息和相关统计结果图表，包括阻断电流、阻断时间、间隔时间的直方图以及阻断电流-阻断时间散点图等；

图4 PyNanoLab软件数据处理界面

(3) 根据直方图的高斯或指数拟合结果，获取各相应参数的统计平均值，误差为三次平行实验结果的标准偏差，绘制阻断时间与电压的关系图。

本实验中，分别定义：开孔电流(I0)为孔道内无分子时的基线电流幅值；阻断电流(ΔI)为单个分子在孔道内时造成的电流变化；残余电流(I)为开孔电流与阻断电流的差值；残余电流程度(I/I0)为残余电流与开孔电流的比值；阻断时间(toff或tD)为单分子阻断事件的持续时间。

5 结果与讨论

5.1 单个生物纳米孔道的I-V表征

如图5所示，T232K/K238Q Aerolysin纳米孔道表现出非对称I-V曲线，表明由于非对称孔道结构以及非均匀分布的孔道测量界面电荷，导致纳米孔道对正负离子的选择性输运差异，从而出现整流现象。计算可得，在+100 mV和−100 mV时，T232K/K238Q Aerolysin纳米孔道整流比R= |I+|/|I−|为1.70 ± 0.08。在0到+160 mV范围内，计算获得相应的孔道电导G=I/V为0.58 ± 0.02 nS。

图5 突变型T232K/K238Q Aerolysin生物纳米孔道的I-V曲线

5.2 单分子多肽阻断电流与阻断时间分析

使用T232K/K238Q Aerolysin纳米孔道分别检测pTau306-316和Tau306-316多肽，实时记录单分子电流响应，可以观察到pTau306-316单分子特征事件的阻断时间(toff)明显大于Tau306-316 (图6a)。如图6b所示，使用一组对应的(I/I0，log(toff))描述每一个单分子事件，根据横纵坐标范围按照100 × 100划分区域，统计落在每个区域内的单分子事件个数作为Counts，据此对整幅图填充相应的颜色，得到log(toff)-I/I0的二维(2D)直方图。结果发现，pTau306-316单分子事件主要分布在P1和P2两个区域范围内，P2区域事件的阻断时间较长且单分子事件的残余电流程度(I/I0)分布集中；而Tau306-316单分子事件主要分布在P1区域内，阻断时间大多在1 ms以下。进一步，图6c将I/I0按照横坐标0.0-1.0范围等分为100个子区间，统计每个I/I0子区间内的单分子事件数量作为纵坐标Counts，得到100组(I/I0，Counts)，绘制I/I0的一维统计直方图。分析可得，pTau306-316和Tau306-316的阻断电流程度也存在一定的差异，pTau306-316单分子事件在P2区域的I/I0= 0.46 ± 0.01。由此可知，pTau306-316和Tau306-316两种多肽在纳米孔道内的动态行为具有显著差异。推测是由于丝氨酸磷酸化增加了pTau306-316的带电量，改变了其与T232K/K238Q Aerolysin纳米孔道测量界面氨基酸残基之间的静电相互作用。

图6 pTau306-316和Tau306-316多肽的阻断电流信号特征图(a)；log(toff)-I/I0 2D直方图(b)和I/I0统计直方图(c)

5.3 单分子多肽穿孔行为解析

为了探究单分子多肽的动态行为与过孔机制，进一步考察了pTau306-316和Tau306-316两种多肽的阻断时间与外加电压的依赖关系。结果显示，在80-120 mV范围内，随着电压的升高，pTau306-316的阻断时间呈现增加的趋势(图7a)，而Tau306-316的阻断时间则基本不变(图7b)。根据文献报道[40]，两种多肽的动态行为模式不同。负电性较强的pTau306-316所受外加电场的驱动力更大，更容易被捕获，随后被捕获的多肽向着孔道trans侧前进，直至受到较强阻力后被迫退出孔道，返回到cis侧溶液中(图7c)。与pTau306-316 (pI = 3.84)不同，Tau306-316 (pI = 5.82)在pH 8.0条件下基本不带电[31]，在cis侧与孔道碰撞之后，几乎不进入孔道，更倾向于继续在溶液中随机运动，故其阻断时间随电压无明显变化(图7d)，产生了单个分子在孔口的碰撞信号。因此，通过纳米孔道单分子实验，不仅可以得到单分子水平的阻断电流和阻断时间特征等，还能够获得单个分子的动态行为信息，这与整体测量方法(如质谱)相比，能够帮助学生们更好地理解分子个体的异质性并激发他们探索微观世界的热情。

图7 两种多肽的阻断时间-电压依赖性关系图和动态行为解析示意图

5.4 多肽混合样品的纳米孔道单分子检测

依次添加Tau306-316、pTau306-316两种多肽，实时监控T232K/K238Q Aerolysin纳米孔道的电流响应变化。如图8所示，在添加多肽样品前，记录得到的开孔电流基线几乎无背景信号；当加入Tau306-316时，观察到了阻断时间很短的脉冲型的单分子电流阻断信号；紧接着加入pTau306-316，出现了阻断时间较长、阻断电流幅值比较均一的台阶型的单分子特征信号，这与单一样品检测结果一致。综上，T232K/K238Q Aerolysin纳米孔道能够用于多肽磷酸化的单分子测量，通过进一步优化孔道界面与待测物分子的相互作用特性，未来有望实现多种多肽/蛋白质翻译后修饰的同时识别。纳米孔道单分子检测研究通常使用特征事件频率来定量表征待测物浓度，由于课堂时间有限，综合考虑实验教学目的以及教学量，将分析物定量检测内容作为拓展实验部分，布置给感兴趣的学生课堂外进一步思考和探索。

图8 T232K/K238Q Aerolysin纳米孔道实时检测多肽混合物

6 实验注意事项

(1) 添加磷脂溶液时，移液器的吸头不要伸入检测池液面以下；

(2) 溶液提拉速度会影响磷脂成膜质量，应缓慢提起并慢慢放掉溶液；

(3) 检测池中磷脂溶液的浓度会影响磷脂膜的厚度，需要根据实验的具体情况，适当地调节磷脂溶液的添加量；

(4) 电压过高容易导致出现多个生物纳米孔道，当形成单个孔道后，应立即将电压降低至100 mV以下；

(5) 孔道蛋白活性影响成孔难易程度，由于不同批次蛋白的活性可能存在差异，可通过调节添加蛋白的浓度或体积，确保磷脂膜上仅形成单个生物纳米孔道；

(6) 清洗检测池时，提醒学生戴好口罩、手套及护目镜。

7 实验设计与组织运行方式

本实验内容包括仪器操作、磷脂膜制备、纳米孔道构建、数据处理分析等，重点和难点是在平面的双分子层磷脂膜上构建单个生物纳米孔道。实验设计时长为每周5学时，共4周。依据教学要求和教学目标，精心设计实验内容，共分为4部分，通过4个阶段完成实验，具体如下：

(1) 第1周，介绍纳米孔道技术原理及研究进展，使学生系统性地了解纳米孔道技术的发展历程与应用前景，调动学生的学习热情，启发学生查阅相关文献资料，探究纳米孔道电化学领域面临的挑战与机遇，培养学生发现问题与解决问题的能力；

(2) 第2周，讲解并演示纳米孔道电化学测量仪器操作与单分子实验方法。结合教学视频帮助学生了解整个实验流程，指导学生认真学习从仪器设置到磷脂膜制备、孔道构建以及单分子检测等每一步实验操作，帮助学生在实验实践过程中加深对相关基础理论知识的理解和运用；

(3) 第3周，学生分组协作独立完成生物纳米孔道单分子检测实验并学习数据处理。学生分工合作进行实验操作，帮助学生提取解析单分子数据的电流、时间特征，并与质谱手段等获取的溶液中大量分子的平均测量结果进行对比，在单分子水平上更好地理解分子的动态行为，培养学生团队合作意识并充分调动学生自主学习的积极性；

(4) 第4周，头脑风暴与自由讨论。鼓励学生大胆提出实验设想并分享对“纳米孔道电化学”的新认知，通过“模拟科研”的方式，发掘学生的科研潜能并培养其创新思维，旨在建立实验教学与科学研究之间的联系，为学生今后的专业课学习和科研工作打下基础。

该实验课程适用于小班教学，每次面向10-15名本科生授课，按照学号排序，每2-3名学生组建成1个实验小组，教师及助教引导学生合理分工，合作完成实验课程的全部内容。为了全面考查学生的学习情况和动手、思考、交流以及团队合作能力等，课程考核以小组为单位，内容涵盖综述论文、实验操作、实验报告和小组汇报4个部分，通过评估每位学生在论文写作、实验实践、结果分析与PPT汇报等方面的课堂整体表现，制定最终成绩，其中科研综述论文撰写占比20%，实验操作占比20%，实验结果和实验报告占比30%，研究方案设计与分组汇报占比30%。在往期实验课程中，> 90%的学生小组都能够完成实验并收集到课程要求的实验数据，学生在实验中善于发现与解决问题，结合实验实践在头脑风暴与自由讨论阶段大胆提出进一步实验设想，包括基于生物纳米孔道的核苷类药物代谢反应监测、单分子多肽/蛋白质构象研究以及纳米孔道光电检测等[29]。根据学生反馈意见以及科研进展情况，教学团队及时总结分析实验教学中遇到的问题，综合考虑实验难度和课程前沿性，改善和优化教学方案。近几年，单分子多肽/蛋白质检测和测序逐渐成为纳米孔道电化学领域的研究前沿，教学团队将这一热点融入到实验教学，设计了“生物纳米孔道检测单分子多肽磷酸化”的实验教学方案。在前期教学团队课题组本科学生中的实践经验表明，本科二年级和四年级学生以及研究生新生均能很快独立完成生物纳米孔道检测多肽的实验，表明该实验具有高度的可行性，对于不同院校根据自身研究特色制定合适教学方案具有重要的参考意义。

8 结语

在当今的后基因组时代，纳米孔道电化学领域的研究热点逐渐发展为单分子多肽/蛋白质的检测和测序，磷酸化、乙酰化、甲基化等蛋白质翻译后修饰是其重要研究内容。笔者在制定实验方案时，将兴趣为导向、学生为中心作为指导思想，综合考虑了实验的可操作性、创新性以及学生的适应性和接受度，确保实验具有适度的挑战性，能够增强学生的学习信心和科研热情，充分发挥“科教融合”对教学改革和高素质人才培养的重要促进作用。本实验利用突变型T232K/K238Q Aerolysin生物纳米孔道检测多肽磷酸化，研究对象为丝氨酸磷酸化的Tau多肽，其与阿尔兹海默症等多种退行性疾病相关。由于磷酸化增加了丝氨酸的负电性并改变了其体积，突变型T232K/K238Q Aerolysin纳米孔道232位点正电荷的增加可增强静电相互作用，而238位点谷氨酰胺的引入则增加了分子过孔能垒，因此，能够很好地应对因多肽过孔速度太快而难以实现准确测量的难题。本实验原理简单、现象明确，便于学生理解和掌握，具有较强的可设计性和推广价值，不局限于多肽磷酸化检测，允许拓展DNA损伤识别、蛋白构象研究、生物标志物检测、离子选择性测量等内容[41-47]。此外，MinION、Orbit Mini、eONE等商品化仪器设备以及α-Hemolysin等商业化孔道蛋白也可应用于纳米孔道实验教学，不同院校可根据具体情况选择合适的教学方案。在前期教学过程中，很多学生表示这是第一次接触单分子实验，希望以后有机会能够参与相关课题研究，进一步了解纳米孔道电化学及其交叉领域前沿进展。这充分表明了将具有重大应用前景的科学技术转化为本科教学内容，实现实验教学与前沿研究并轨，对于培养学生的综合创新能力和推动“全面的化学教育”具有重要教学意义。

致谢：感谢研究生牛红艳和霍明珠的助教工作、张琳琳对纳米孔道仪器的调试和维护，以及本科学生刘宇航、储文浩参与突变型生物纳米孔道的实验。