玉米S1Fa-like 转录因子基因家族的鉴定与表达分析

赵东波，高建胜，郭建军，李拥军，薛 鑫，郭良海

（1.德州市农业科学研究院,山东 德州 253015;2.德州学院,山东 德州 253023）

转录因子通过激活或者抑制相关基因的表达，提高植物的非生物胁迫耐受性。转录因子S1Fa 最早从菠菜中发现，是含有70 个氨基酸的小肽，负调控rps1 表达，其保守结构域包含核定位信号和特定的DNA 结合位点，在双子叶植物和单子叶植物之间高度保守，主要在根和黄化幼苗等组织中表达。S1Fa-like TFs（transcription factors）的数量在不同的植物种类中差异很大。大多数植物不超过5 个S1Fa-like 家族成员；然而花生基因组中含有126 个S1Fa-like 转录因子，且被鉴定为膜结合型转录因子。越来越多的研究发现，S1Fa-lik TFs 响应植物的非生物胁迫，如甘蓝型油菜（Brassica napus）中S1Fa-like响应盐胁迫刺激；棉花（Gossypium hirsutum）中S1FalikeTFs 大多数成员受非生物胁迫刺激表达量下调；杨树（Populus trichocarpa）中PtS1Fa1 和PtS1Fa2 的表达受到干旱和盐胁迫的抑制，且响应ABA、MeJA、SA等激素刺激，其中PtS1Fa2 通过增加抗氧化剂活性，减少活性氧（ROS）积累，进而增强杨树的耐旱性。

植物在生长发育过程中必须应对非生物胁迫，如土壤盐度、干旱和极端温度。然而，关于玉米S1Fa-like TFs 生物信息学、组织表达及胁迫调控表达模式的研究未见报道。本研究采用生物信息学方法，分析玉米S1Fa-like TFs 基因结构、染色体定位、蛋白理化性质、进化关系及组织表达和胁迫表达模式，通过qRT-PCR 技术检测玉米S1Fa-like TFs 受热胁迫时的表达量，为深入解析玉米S1Fa-like TFs在响应非生物胁迫应答中的生物学功能奠定基础。

1 材料和方法

1.1 基因家族的鉴定、蛋白质理化性质及亚细胞定位分析

从PlantTFDB（http://planttfdb.gao-lab.org/）查询S1Fa-like TFs 成员，并利用Pfam（http://pfam.xfam.org/）对得到的蛋白序列进行保守结构域验证。利用Expasy 中的ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/)工具获取蛋白质理化性质信息，Plant-mPLoc（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）进行蛋白亚细胞定位分析。

1.2 家族蛋白进化和二级结构预测分析

通过PlantTFDB 获取单子叶植物（大麦、玉米、籼稻、粳稻、高粱、小麦、乌拉尔小麦）和双子叶植物（猕猴桃、拟南芥、油菜、大豆、棉花、杨树、菠菜）共14 种作物的S1Fa-like TFs 蛋白序列，利用MEGA7.0软件中最大似然法（Maximum Likelihood，bootstrap=1000）构建系统发育树。利用在线网站SOMPA（http://www.prabi.fr/）预测蛋白二级结构。

1.3 保守基序、基因结构及启动子分析

利用在线工具MEME（http://memesuite.org/）对家族蛋白进行motif 分析，预测基因家族成员的保守结 构 域。使 用PlantCare（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在线预测ZmS1Fas启动子区域(ATG 上游2 000 bp)顺式调控元件。

1.4 基因组织表达和诱导表达模式分析

从MaizeGDB qTeller 数据库下载正常组织部位的表达数据（登录号PMC5808982），NCBI 数据库下载受干旱胁迫根部位转录组数据（登录号SRP052697）和不同玉米材料苗期受温度胁迫地上部位转录组数据（登录号SRP106663），利用TBtools软件中HeatMap 进行可视化处理。

1.5 qRT-PCR 检测基因家族成员热胁迫表达量

玉米自交系B73 和Oh43 材料，在16/8 h 光照培养室长日照条件下培养至3 叶期（14 d）。玉米苗被置于42 ℃培养箱中处理4 h，对照则正常条件培养，每个样本处理6 株幼苗。收集幼苗地上部分，液氮中研磨，提取RNA，反转录之后以ZmActin1 为内参，检测ZmS1Fas 胁迫处理前后的相对表达量，并采用GraphPad Prism 软件作图。所用引物序列见表1。

表1 荧光定量PCR 引物

2 结果与分析

2.1 ZmS1Fas 的鉴定、理化性质、亚细胞定位分析及蛋白二级结构预测

从PlantTFDB 获取S1Fa-like 家族成员蛋白序列，经Pfam 检验，结果显示（图1-C），家族成员均含有S1FA 或S1FA superfamily 保守结构域。根据染色体位置命名为ZmS1Fa1、ZmS1Fa2（图2），ZmS1Fa1位于2 号染色体、ZmS1Fa2 位于10 号染色体。ZmS1Fas 共编码5 个蛋白（4 种不同蛋白，表2），蛋白长度为56～80 个氨基酸；分子量在6 310.77～8 867.10 Da 之间；等电点在9.82～10.25 之间，均为碱性蛋白；不稳定系数在33.18～37.49 之间，均小于40，属于稳定蛋白；脂肪指数在101.00～105.27 之间，具有良好的热稳定性；亲水性系数在-0.049～0.070 之间，表明ZmS1Fas 家族成员亲水性氨基酸和疏水性氨基酸基本持平；亚细胞定位结果显示，ZmS1Fas 家族成员均定位在细胞核内。蛋白二级结构分析结果表明（表3），其α-螺旋、延长链、β-转角、无规则卷曲等蛋白质二级结构在ZmS1Fas 基因家族成员中均有分布且占比差别不大。

图1 ZmS1Fas 系统进化树（A）、保守基序（B）、保守结构域（C）和基因结构（D）

图2 ZmS1Fas 基因染色体定位

表2 ZmS1Fas 蛋白理化性质

表3 ZmS1Fas 蛋白二级结构

2.2 ZmS1Fas 系统进化、保守基序及基因结构分析

将单子叶和双子叶植物共14 种作物的51 个S1Fa-like 蛋白氨基酸序列进行多重比对，并构建系统进化树（图3）。结果表明，单子叶植物与双子叶植物被分开，说明S1Fa-like 家族快速扩增可能发生在单子叶植物与双子叶植物分化之前。ZmS1Fas 和高粱S1Fa-like 家族成员具有较高的亲缘关系。对ZmS1Fas 蛋白进行motif 分析，结果（图1-B）显示：ZmS1Fas 保守基序较简单，均含有motif1（含50 个氨基酸），占ZmS1Fas 蛋白长度的62.5%～89.3%，推测其为ZmS1Fas 基因家族成员的核心功能区域。ZmS1Fas 的基因结构相对保守（图1-D），均含有1～2 段外显子，0～1 段内含子，且均具有5'UTR 和3'UTR。

图3 S1Fa-like 基因家族系统进化树

2.3 ZmS1Fas 顺式作用元件分析

检索ZmS1Fas 启动子上已知的激素和胁迫相关的响应元件，结果显示（图4），ZmS1Fas 启动子区域含有丰富的激素（脱落酸、水杨酸、乙烯、茉莉酸、茉莉酸甲酯、生长素、赤霉素等）和胁迫（如高温、低温、干旱、厌氧、损伤等）相关的响应元件。尤其脱落酸响应元件，ZmS1Fas 成员平均含有13.2 个；其次是茉莉酸和茉莉酸甲酯响应元件，平均含有8.6 个。干旱响应元件也很丰富，在ZmS1Fa1.1、ZmS1Fa1.2和ZmS1Fa2.3 的启动子区均含有10 个以上。

图4 ZmS1Fas 启动子区域激素和胁迫相关顺式作用元件的分布

2.4 ZmS1Fas 基因组织表达和胁迫表达分析

由图5 可知，正常条件下，除B73 成熟花粉（B73 Mature Pollen），各组织均有ZmS1Fas 基因表达，且多数组织中ZmS1Fa2 的表达量均比ZmS1Fa1的表达量高。授粉12 d 的胚乳（Endosperm 12 DAP）中ZmS1Fa 基因的表达量均高于其他组织部位中的表达量，B73 成熟花粉中表达量均低于其他部位的表达量。ZmS1Fa2 在根皮层、授粉27 d 的果皮、6～7节间、花丝等部位表达量也较高。

图5 正常条件下ZmS1Fas 表达模式分析

由组织表达模式可知，在根部位ZmS1Fas 表达量较高，选取根部位干旱胁迫表达数据，结果显示（图6），受干旱胁迫，其ZmS1Fas 转录水平并未达到显著上调或下调，推测ZmS1Fas 转录因子家族可能在蛋白质水平响应干旱胁迫。

图6 受干旱胁迫ZmS1Fas 在根部位的表达

由图7 可知，自交系Oh43 和杂交种Oh43×B73受高温胁迫，ZmS1Fas 均显著上调表达；自交系PH207 受低温胁迫，ZmS1Fas 均显著下调表达。不同玉米材料中，ZmS1Fas 响应温度胁迫模式不同，为选育耐高温或低温的玉米种质提供了理论支持，为玉米遗传改良提供潜在的基因资源。

图7 不同玉米材料受温度胁迫ZmS1Fas 的表达

2.5 ZmS1Fas 热调控表达模式分析

为进一步明确ZmS1Fas 基因热胁迫表达模式，以ZmActin1 为内参，检测自交系B73 和Oh43 热胁迫表达量。设置正常条件下基因的相对表达量（CK）为1，结果（图8）表明，ZmS1Fa1 和ZmS1Fa2 在B73中均受热胁迫轻微下调表达；而在Oh43 中受热胁迫显著上调表达，受热胁迫处理材料中ZmS1Fa1 和ZmS1Fa2 表达量约是正常生长材料表达量的2 倍。与生物信息学预测结果基本一致，不同材料中ZmS1Fas 基因响应热胁迫模式不一致。笔者推测ZmS1Fas 在玉米响应非生物胁迫方面具有潜在的功能。

图8 热胁迫条件下ZmS1Fas 的相对表达量

3 结论与讨论

目前，玉米中许多逆境胁迫相关基因家族已经被鉴定和分析，如VOZ、GATA等基因，而关于S1Fa 基因的研究少之又少。本研究在玉米中共鉴定到2 个ZmS1Fas 基因，均含有S1FA 或S1FA superfamily 保守结构域，共编码5 个蛋白，长度为56～80 个氨基酸；分子量在6 310.77～8 867.10 Da 之间；均为碱性蛋白；不稳定系数均小于40，属于稳定蛋白，具有良好的热稳定性；α-螺旋、延长链、β-转角、无规则卷曲等蛋白质二级结构占比差别不大。ZmS1Fas 蛋白均定位在细胞核内。将大麦、玉米、籼稻、粳稻、高粱、小麦、乌拉尔小麦、猕猴桃、拟南芥、油菜、大豆、棉花、杨树、菠菜等14 种作物的51 个S1Fa-like 蛋白氨基酸序列进行多重比对，发现单子叶植物和双子叶植物的S1Fa-like 蛋白具有高度保守性。ZmS1Fas 保守序列较简单，motif1 是ZmS1Fas基因家族成员的核心功能区域。ZmS1Fas 均含有1～2 段外显子，0～1 段内含子，且均具有5'UTR 和3'UTR。ZmS1Fas 启动子区域含有丰富的与激素响应和非生物胁迫相关的调控元件。笔者推测S1Fa 转录因子作用元件可能参与植物逆境胁迫的响应，有利于植株的生长发育。

在正常生长条件下，除B73 成熟花粉(B73 Mature Pollen)，各组织均有ZmS1Fas 基因表达，且多数组织中ZmS1Fa2 的表达量均比ZmS1Fa1 的表达量高。受到干旱胁迫时，ZmS1Fas 在转录水平与正常生长材料中表达量差异不显著。自交系Oh43 和杂交种Oh43×B73 受高温胁迫，ZmS1Fas 均显著上调表达；自交系PH207 受低温胁迫，ZmS1Fas 均显著下调表达。qRT-PCR 检测了热胁迫时ZmS1Fas 基因的表达量，结果表明，ZmS1Fa1 和ZmS1Fa2 在B73中均受热胁迫轻微下调表达；而在Oh43 中受热胁迫显著上调表达，与生物信息学预测的“ 不同玉米材料中ZmS1Fas 响应温度胁迫模式不同” 结果一致。这表明S1Fa 基因在复制后有可能发生功能分化，从而导致S1Fa 基因的功能多样性，促进了植物的生长调控和对自然环境的适应，为进一步解析ZmS1Fas在响应非生物胁迫应答中的生物学功能奠定基础。