拟除虫菊酯类农药半抗原专利技术分析

梁艳辉，陈翠翠

(国家知识产权局专利局专利审查协作江苏中心，苏州 215163)

拟除虫菊酯类农药是一类模拟天然除虫菊酯化学结构合成的农药，低毒，具有无特殊臭味、安全系数高、使用浓度低、触杀作用强、灭虫速度快、残效时间长等优点。拟除虫菊酯主要应用于农业，例如防治棉花、蔬菜和果树食叶和食果害虫。在高毒有机磷农药被禁止使用后，拟除虫菊酯农药便有了更为广泛的应用。除此之外，拟除虫菊酯还作为家庭用杀虫剂被广泛应用，用于防治蚊蝇、蟑螂及牲畜寄生虫等。目前，人工合成的拟除虫菊酯种类数以万计，迄今商品化的拟除虫菊酯有近40个品种，在全世界的杀虫剂销售额中占20%左右[1]。根据拟除虫菊酯独特的杀虫症状及其对昆虫神经钠离子通道门控的影响，此类物质被分为Ⅰ型和Ⅱ型(图1)。在结构上，Ⅰ型和Ⅱ型拟除虫菊酯的区别主要在于醇基α-碳的位置是否存在氰基，Ⅰ型拟除虫菊酯不存在α-氰基(例如氯菊酯、丙烯菊酯、联苯菊酯)，Ⅱ型拟除虫菊酯存在α-氰基(例如氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯)[2]。

图1 I型和II型拟除虫菊酯类农药结构通式

由于拟除虫菊酯类化合物具有疏水性和光稳定性，能够长期稳定地残留在农产品和环境基质中，进而通过生物链进入生物体内，严重危害到环境安全和人类健康，因此，检测环境、食品、人体中拟除虫菊酯类杀虫剂的残留十分必要[3]。

针对拟除虫菊酯类杀虫剂常用的检测方法包括高效液相色谱法、气相色谱电子捕获法以及气相色谱-质谱等。虽然这些方法的灵敏度高，但样品需要复杂的前处理过程，分析时间长并且仪器昂贵，技术要求高，不适合大量样品的快速检测。随着免疫分析技术的发展，农药免疫分析法不但具备了与仪器分析法相当或更高的灵敏度，且无需使用昂贵仪器，方法简便，在农药残留的快速筛选中已显示出独特的优势。

由于拟除虫菊酯类农药为小分子化合物(分子量小于1 000 kD)，不具有免疫原性，因此，拟除虫菊酯类农药免疫检测技术的建立，关键在于半抗原的涉及和改造，通过适当的化学方法加以适当的修饰，使其分子结构的某个位置上带上端基为活性基团的连接臂，使其转变为带有游离氨基或游离羧基的衍生物，从而与大分子载体相连接，生成半抗原-载体的偶联物，此偶联物即为人工抗原。

笔者检索了国内外涉及拟除虫菊酯类农药半抗原设计与合成的发明专利并对申请人、发明内容等进行梳理，以期为拟除虫菊酯类农药半抗原或人工抗原的研究或相关发明专利的挖掘提供参考。

1 申请人、申请量特点

从申请年度和申请量来看，全球有关拟除虫菊酯类农药半抗原或人工抗原的发明专利总量在100件以内，发明点涉及半抗原设计或合成的约50件，且申请时间多集中于2005-2019年，近两年申请量较少，可见，研发热度不是很高。国内申请人占90%以上，绝大多数为高校和科研院所，其中申请较多的申请人包括江南大学、扬州大学、南京农业大学、浙江大学、中国农业科学院油料作物研究所等，仅在2019年后出现企业申请人，例如苏州快捷康生物技术有限公司、北京勤邦生物技术有限公司、广州勤邦生物技术有限公司、北京望尔生物技术有限公司等。由此可见，目前拟除虫菊酯类农药半抗原的研究仍处于基础研究阶段，成熟的、商业化免疫检测试剂盒较少。

2 相关专利法律状态

对上述发明点为半抗原设计或合成的专利的法律状态统计如表1所示，可见，目前维持有效或审查中的专利占比较小，说明相关研究主体对拟除虫菊酯类农药半抗原的设计和合成热度不是很高，或者拟除虫菊酯类农药半抗原的设计或合成存在较难跨越的瓶颈，短期内无法获得具有创新性的有效的半抗原化合物。由于目标物半抗原分子设计的合理性是免疫分析方法中抗体制备的关键，涉及半抗原结构的设计与合成的专利申请量低，因此，涉及后续人工抗原制备、载体蛋白选择、抗原鉴定等内容的专利申请量也相应较少。

表1 涉及半抗原设计或合成专利的法律状态

3 半抗原的设计与合成

拟除虫菊酯农药主要由酸结构和醇结构2部分构成，这类农药的半抗原设计与合成根据活性基团引入位置的不同归纳为以下4类：在拟除虫菊酯的酸或醇部分引入活性基团、对拟除虫菊酯的氰基部分转化引入活性基团、在末端芳香环上引入活性基团、对拟除虫菊酯环丙烷进行修饰引入活性基团。

对检索到的发明专利文献的发明点进行梳理可知，拟除虫菊酯类农药半抗原包括特异型和通用型2种，特异型半抗原主要涉及氰戊菊酯、甲氰菊酯、溴氰菊酯、联苯菊酯、高效/氯氟氰菊酯、氟氯氰菊酯、氯菊酯等，通用型半抗原主要是根据拟除虫菊酯的结构差异分为针对I型和Ⅱ型拟除虫菊酯的通用型半抗原以及醚型菊酯类农药通用半抗原。

3.1 氰戊菊酯半抗原合成

刘曙照等(CN1624480A)以氰戊菊酯的菊酸部分作为半抗原，引入长度不等的碳链作为间隔臂，具体为将2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酰氯与氨基酸缩合获得半抗原(图2)。程敬丽等(CN1789238A)将氰戊菊酯的氰基水解为羧酸，引入β-丙氨酸间隔臂，然后与载体蛋白偶联得到氰戊菊酯人工抗原。

图2 氰戊菊酯半抗原

3.2 溴氰菊酯半抗原合成

王硕等(CN101747428A)、天津九鼎医学生物工程有限公司(CN103529198A，专利法律状态：有效)以二溴菊酸部分作为半抗原的基本结构，与氨基酸缩合获得6-{[3-(2,2-二溴-乙烯基)-2,2-二甲基-环丙基羰基]-氨基}-己酸作为半抗原。王鸣华等(CN101412673A)将溴氰菊酯中的氰基转化为羧基和含羧基的酰胺获得溴氰菊酯人工半抗原，李相前等(CN102807614A)先将溴氰菊酯中的氰基转化为羧基，再与3-巯基丙酸甲酯合成获得半抗原。赵建庄等(CN1948964A)、北京农学院(CN101339189A)通过在溴氰菊酯的末端苯环上引入硝基制备半抗原，并建立了食品中溴氰菊酯农药的间接ELISA法，灵敏度为0.100~0.237 μg/mL，线性范围为0.015~100 μg/mL，IC50为4.786~7.709 μg/mL，回收率为86.2%~105.8%，与其他菊酯类农药几乎无交叉反应。

3.3 甲氰菊酯半抗原的合成

吴伟等(CN101017165A)以甲氰菊酸为半抗原，应用碳二亚胺将甲氰菊酸和牛血清蛋白偶联，构建出甲氰菊酯人工抗原，克服了其他方法繁琐、生产率低、特异性差等缺点。贵州勤邦食品安全科学技术有限公司(CN106918705A)公开了检测甲氰菊酯的试纸，其中使用的甲氰菊酯半抗原合成路线如图3所示，该半抗原通过在甲氰菊酯的末端苯环上引入具有碳链间隔臂的羧基，并与载体蛋白(牛血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或甲状腺蛋白)偶联获得人工抗原，进而制备获得试纸。该试纸检测对茶叶样品中的甲氰菊酯的检测限为2 mg/kg，对茶青样品中的甲氰菊酯的检测限为1 mg/kg，并且与多菌灵、三唑醇、甲菌灵无交叉反应。北京勤邦生物技术有限公司(CN111735951A)则通过在甲氰菊酯的环丙烷上引入羧基制备半抗原(图3)，并与载体蛋白(牛血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或甲状腺蛋白或人血清蛋白)偶联获得人工抗原，进而制备获得试纸，用于快速检测黄瓜、苹果等蔬菜及水果中的甲氰菊酯残留，最低检测限为50 μg/kg，该试纸条对500 μg/kg溴氰菊酯、氯氟氰菊酯等药物无交叉反应。苏州快捷康生物技术有限公司(CN110776567A)则通过在甲氰菊酯末端苯环上引入活性基团氨基，制备获得抗甲氰菊酯单克隆抗体，甲氰菊酯试纸条灵敏度为5 ng/mL，与三氟氯氰菊酯、功夫菊酸、氯氰菊酯、溴氰菊酯、联苯菊酯、氰戊菊酯、醚菊酯和胺菊酯这8种农药没有交叉反应，可见其灵敏度高、特异性良好。

图3 甲氰菊酯半抗原

3.4 高效/氯氟氰菊酯、氟氯氰菊酯半抗原的合成

陈秀金等(CN103911348A，专利法律状态：有效)将半抗原1即H1：3-氰[顺-3-[2-氯-3,3,3-三氟乙基-2-二甲基]环丙烷-苯氧基]苯丙酸，通过活性酯法和血蓝蛋白KLH偶联；然后将半抗原2即H2：氰基-3-(4-氨基苯氧基)苯基-顺-3-[2-氯-3,3,3-三氟乙烯基-2,2-二甲基]环丙烷酸酯，通过重氮化法和牛血清白蛋白偶联，用作包被原；最后通过动物免疫、血清测定、细胞融合、筛选和亚克隆技术得到细胞株16号。采用小鼠体内诱生法生产腹水，然后通过辛酸-硫酸铵沉淀法纯化得到相应的单克隆抗体；该抗体灵敏度高，半数抑制浓度(IC50)为(13.26±1.23) ng/mL；特异性强，为国内农产品中高效氯氟氰菊酯的残留检测提供了技术。

罗世能等(CN101519364A)以氯氟氰菊酯为原料，对其直接硝化，在苯环上引入硝基，进而用SnCl2·2H2O还原，制备出末端苯环上含有活性基团－NH2的半抗原CY，半抗原CY(图4)通过重氮法成功与牛血清白蛋白(BSA)偶联，获得氯氟氰菊酯人工抗原CY-BSA。王利兵(CN102417468A)以对羟基苯丙酸为原料，经过7步反应，在高效氯氟氰菊酯的末端苯环上引入了以碳链作为连接臂的羧基。曹立民等(CN111269139A)以高效氯氟氰菊酯为原料，通过一步法将氰基转变为氨基获得高效氯氟氰菊酯的半抗原，并通过碳二亚胺法与活化载体蛋白偶联获得半抗原-OVA偶联物，即高效氯氟氰菊酯完全抗原，用于生成多克隆抗体。该抗体对高效氯氟氰菊酯的最低检出限为10 μg/L，对其他拟除虫菊酯类农药(溴氰菊酯、氯氰菊酯、氟氯氰菊酯和氰戊酸酯)无明显交叉反应。贵州勤邦食品安全科学技术有限公司(CN105732788A)以高效氯氟氰菊酯为原料与琥珀酸酐经一步反应在末端苯环引入活性基团羧基获得半抗原，用间接竞争ELISA法测定相应抗体的效价为1∶100 000~150 000，并且与氯氰菊酯、氰戊菊酯没有交叉反应，该公司还以该半抗原为基础，申请了检测高效氯氟氰菊酯残留的试纸卡(CN105807056A)、检测高效氯氟氰菊酯残留的试剂盒(CN105807041A) 2项发明专利。

北京勤邦生物技术有限公司(CN113024415A)通过在环丙烷位置引入活性基团羧基制备得到氟氯氰菊酯半抗原(图4)，由所述半抗原获得的氟氯氰菊酯抗体灵敏度可达到0.1 μg/L，采用间接ELISA方法测定抗体效价，效价≥100 000，与其他菊酯类杀虫剂(甲氰菊酯、氯氟氰菊酯、氰戊菊酯、联苯菊酯、氯菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、醚菊酯)的交叉反应率低。

3.5 联苯菊酯、氯菊酯半抗原合成

深圳市易瑞生物技术有限公司(CN105669482A，专利法律状态：有效)以功夫酸为起始原料设计合成了联苯菊酯半抗原(图5)，基于此半抗原制备得到的检测试纸具有特异性强，检测灵敏度高，检测限达到150 μg/L。

王鸣华等(CN101135683A)以联苯醇为起始物，分别制备了联苯菊酯半抗原2-甲基-3-苯基苄基丁二酸酯LBc、2-甲基-3-苯基苯甲酸Lby，再采用碳二亚胺法将半抗原与牛血清蛋白偶联获得人工抗原，经免疫动物产生特异性抗体，效价为5.12×105，对联苯菊酯最低检测限为0.016 mg/L，与氟氯氰菊酯、溴氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯、甲氰菊酯无交叉反应。张亮等(CN110850090A)以拟除虫菊酯类杀虫剂中间体(图5)为原料，在环丙烷上引入带羧基的活性基团获得联苯菊酯半抗原(图5)，并制备了检测联苯菊酯的试纸条。该试纸条对联苯菊酯的检测限为15 mg/kg，对500 mg/kg氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯等药物无交叉反应。苏州快捷康生物技术有限公司(CN109942710A，专利法律状态：有效)设计了新颖的联苯菊酯半抗原(图5)，并制备了相应的单克隆抗体，所述单克隆抗体特异性识别联苯菊酯，与其他拟除虫菊酯类杀虫剂无交叉反应；利用本发明提供的抗联苯菊酯抗体实现的竞争ELISA的抑制中浓度(IC50)为20 ng/mL，检测限(IC10，LOD)为0.5 ng/mL，优于目前已报道的联苯菊酯抗体。

日本KANKYO MENEKI GIJUTSU KENKYUSH公司(JP2001278844A)在氯菊酯的一部分导入间隔臂和能够用于结合的官能团获得氯菊酯的两种半抗原化合物，式1、式2 (图5)。

图5 联苯菊酯、氯菊酯半抗原

3.6 通用型半抗原合成

3.6.1 I型拟除虫菊酯类通用型半抗原

李培武等(CN101407458A，专利法律状态：有效)以间苯氧基苯甲醇和丁二酸酐为原料合成了I型拟除虫菊酯类通用半抗原化合物4-羰基-4-(3-苯氧基甲氧基)丁酸，合成路线如图6，并基于同一种半抗原发明了I型拟除虫菊酯流动之后免疫时间分辨荧光速测试剂盒(CN106932586A)、杂交瘤细胞株QW8#及其产生的抗Ⅰ型拟除虫菊酯通用单克隆抗体(CN106701689A)，其灵敏度高、特异性好，对醚菊酯的50%抑制浓度IC50为20.86 μg/L，对氯菊酯的50%抑制浓度IC50为24.2 μg/L，对苯醚菊酯的50%抑制浓度IC50为29.4 μg/L，对其他Ⅰ型和Ⅱ型拟除虫菊酯的交叉反应率均小于1%，可应用于Ⅰ型拟除虫菊酯的多残留检测。

图6 CN101407458A中半抗原合成路线

3.6.2 II型拟除虫菊酯类通用型半抗原

李培武等(CN101407475A)以α-氰基间苯氧基苯甲醇和丁二烯酰氯为原料合成II型拟除虫菊酯类通用半抗原化合物α-氰基(3-苯氧基苯基)甲基-4-氯-4-羰基丁酸酯，合成路线如图7。胥传来等(CN101157638A)以间苯氧苯甲醛为原料，通过2步反应合成间苯氧基苯甲氰醇丁二酸酯，作为含氰基拟除虫菊酯农药的半抗原，合成路线如图7。王立兵、胥传来等(CN102372776A，专利法律状态：有效)以苯醚菊酯为原料，利用高锰酸钾和高碘酸钠进行氧化，得到II型拟除虫菊酯人工半抗原(图7)，由此半抗原制备得到的抗体血清效价为32 000。匡华等(CN102901811A，专利法律状态：有效)基于计算机分子模拟技术对拟除虫菊酯半抗原的电荷性质和空间构象进行构建，合成了6种II型拟除虫菊酯农药半抗原(图7)，预测能产生好的免疫效果的半抗原，通过免疫原的合成和免疫过程，实现识别II型拟除虫菊酯类农药群选择性抗体的制备，具有很好的预测能力。奇华顿股份有限公司(CN103298337A)发明了用于确定样品中II型拟除虫菊酯化合物的存在的体外方法，包括使样品中的II型拟除虫菊酯化合物转变成3-苯氧基苯甲酸或4-氟-3-苯氧基苯甲酸，进而用于免疫分析。

图7 II型拟除虫菊酯类通用型半抗原

3.6.3 醚型拟除虫菊酯类通用型半抗原

睢可等(CN102807488A)合成了图8所示的醚型菊酯的通用半抗原，通过间接Elisa方法检测所述发明制备的抗原所免疫得到的抗血清对醚型菊酯的检测灵敏度为：氯醚菊酯IC50为1.540 2 μg/mL，氟硅菊酯IC50为0.753 9 μg/mL，三氟醚菊酯IC50为0.927 4 μg/mL，并且对I型和II型拟除虫菊酯类农药均无交叉反应，特异性良好。

3.6.4 其他通用型半抗原

江南大学胥传来、匡华等发明人申请了关于多件宽谱特异性半抗原的发明专利，其中CN101219965A (法律状态：有效)以菊酸和4-氨基丁酸为原料通过2步反应合成4-氨基丁酸缩合菊酸半抗原(图8)，用于含菊酸拟除虫菊酯类农药的酶联免疫检测。CN101726589A以3-间苯氧甲酸缩-γ-氨基丁酸(3-PBA-γ-AJDS)为半抗原与载体蛋白偶联获得免疫原，进而得到相应抗体，抗体检测限为0.5~1 μg/kg，与氟胺氰菊酯、甲氰菊酯、λ-氯氟氰菊酯、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯的交叉反应率为100%、18%、76%、39%、8%、7%。CN103149351A以3-苯氧苯甲酸和对硝基苯丙氨酸合成拟除虫菊酯类农药的通用半抗原N-(3-苯氧基苯酰)-4-氨基-L-苯丙氨酸，制备得到的胶体金免疫层析试纸条检测拟除虫菊酯类农药的灵敏度分别为：氯氰菊酯50 ng/mL、甲氰菊酯200 ng/mL、顺氰戊菊酯400 ng/mL，对多种菊酯农药具有识别力， 可用于菊酯农药多残留的粗测。

图8 CN102807488A中醚型菊酯通用半抗原

北京勤邦生物技术有限公司(CN107188830A，专利法律状态：有效)设计合成了菊酯类农药半抗原化合物(图8)，以及该半抗原与人血清白蛋白偶联得到的偶联物作为免疫原免疫动物制备的单克隆抗体。经验证，制备的单克隆抗体对溴氰菊酯、氯氟氰菊酯、氟胺氰菊酯、氟氯氰菊酯、氯戊菊酯、苯氯菊酯6种菊酯类农药具有较好的检测灵敏度。

浙江大学的程敬丽等(CN101215247A)以二甲基菊酰氯、γ-氨基丁酸乙酯和间苯氧基甲醛为主要原料合成半抗原(图8)。该半抗原包含了大多数拟除虫菊酯类农药的3个共性结构部分：双苯氧环、带-CN的酯和三元环结构；CN101412684A以氯氰菊酯为原料制备了高特异性拟除虫菊酯类农药半抗原化合物I (图8)。中国农业科学院油料作物研究所李培武等(CN101434652A)合成了拟除虫菊酯类农药半抗原(图8)，保留了拟除虫菊酯类农药共同具有的酯键结构，有利于制备出高质量抗体，抗体能够特异识别溴氰菊酯、氯氰菊酯、功夫菊酯，与氨基甲酸酯类、有机磷类农药无交叉反应。加利福尼亚大学(US5108900A)制备了对具有苯氧基苄基或苯氧基苯基官能团的拟除虫菊酯类农药具有特异性亲和力的单克隆抗体，其中半抗原为苯醚菊酯的环丙烷二羧酸。

图9 其他通用型半抗原

以上专利中，CN101219965A、CN101407458A、CN1948964A还涉及授权后专利权的转让，其中CN101219965A还涉及到专利权的质押，反映了这些授权专利可能存在一定的商业价值和市场活跃程度，为相关市场以后的布局和侧重点提供参考依据。

4 结 语

本文总结了国内外涉及拟除虫菊酯类农药半抗原设计与合成的发明专利。根据上述分析可知，在专利申请方面，拟除虫菊酯类农药半抗原的设计与合成还有很多可以挖掘空间和很多尚待解决的问题，例如高特异性农药半抗原种类较少，通用型半抗原制备得到的通用型抗体如何进行实际检测应用还有待进一步研究等。在针对拟除虫菊酯类农药的检测中，研究者们日益注重免疫分析技术的开发和应用，免疫分析技术将在拟除虫菊酯类农药残留快速检测中发挥越来越重要的作用。