中药材中玉米赤霉烯酮毒素污染现状及其脱毒研究进展

邓 桃，袁青松，周 涛，江维克*，肖承鸿，杨昌贵，郭兰萍

(1.贵州中医药大学，贵州贵阳 550025；2.中国中医科学院中药资源中心，北京 100700)

随着中药在重大疾病、常见病、疑难杂症的防治上取得巨大的成果，中药材的质量及用药安全也越发受到重视。中药材在种植、采收、运输和贮藏过程中，因方法不当而发生真菌生长(霉变)和毒素积累，直接影响了中药的质量与安全。玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)又称为F-2毒素，由Stob等于1962年首次从赤霉病的玉米中分离得到，其化学结构为一种酚的二羟基苯酸内脂结构，是一种主要由镰刀菌属菌株产生的真菌毒素。ZEN及代谢产物具有雌激素样效应、致癌性以及多种毒性，人类食用被其污染的食物会导致肝癌、睾丸癌、食道癌及青春期早熟等疾病；动物食用后则会影响繁殖机能，导致其繁殖机能紊乱。为保证食用安全，ZEN的膳食允许摄入量及其在各类产品中的含量也被世界上多个组织和国家进行了严格的规定，GB 2761—2011《粮食卫生标准》规定供人类使用的谷物及其制品中ZEN的最高水平是60 μg/kg，2020版《中国药典》也规定薏苡仁中ZEN不得超过500 μg/kg。

该研究对中药材中ZEN污染现状、ZEN脱毒方法以及ZEN生物降解机制等相关文献进行了综述，以期为预防中药材的ZEN污染及其脱毒研究提供参考。

1 中药材中ZEN污染现状

近年来，随着国内外对中药材安全关注度的提高，中药材中ZEN污染的报道也逐渐增多，不同药用部位、不同基质的中药材中ZEN污染情况不尽相同，笔者归纳整理了已报道的不同药用部位中药材中ZEN污染情况(表1)。由表1可知，ZEN在根及根茎类、果实种子类中药材中污染较为广泛，在富含淀粉的根及根茎类药材中ZEN被检出的最大值为4.53 μg/kg，最小值为0.04 μg/kg，在富含油脂类的果实种子类中药材中ZEN污染最为严重，被检出的最大值为325.00 μg/kg；叶、全草类中药材污染报道较少，ZEN被检出值为0.06～29.98 μg/kg；花类药材中尚未发现ZEN的污染。ZEN在薏苡仁中污染最为严重，申红红等检测了薏苡仁、白术、板蓝根等25个中药材及人参健脾丸、黄连上清丸等5个中药制剂中的ZEN，结果8个薏苡仁样品均含有ZEN，且其中3个超过了60 μg/kg。毛丹等对薏苡仁、麦芽、绿豆3种中药材共11批样品中的ZEN进行检验，结果4批薏苡仁均检出ZEN，结果分别为325、30、268和178 μg/kg。张晓飞等检测了薏苡仁、山楂、神曲、麦芽等107个中药样品中的ZEN，有8个阳性样品均为薏苡仁，ZEN的含量在37.1～229.2 μg/kg。

除此之外，Gray等在不同来源的人参、西洋参根的提取物中检出ZEN，其中人参根提取物中最高检出量为11.7 mg/kg，西洋参根的提取物中最高检出量为2.6 mg/kg。陈重均在黄芪颗粒剂中检测到1.63 μg/kg的ZEN。

2 ZEN的脱毒方法

ZEN污染广、毒性强、危害大，如何有效地预防和清除ZEN污染是研究的热点。

物理法主要包括高温处理、辐照处理、物理吸附等。高温处理是将受ZEN污染的粮食、谷物等在110～160 ℃的高温下烘烤，使产生ZEN的菌被杀死。这种方法对ZEN的作用不大，且破坏营养价值，现在已经不采用。辐照法是指用电离辐射线破坏物质结构，促使物质发生一系列物理化学变化，辐照处理后产物的组成、性质以及毒理等尚缺乏研究。物理吸附法是指采用蒙脱石、活性炭、葡聚糖等吸附剂，利用分子间作用力、化学键等作用，使吸附剂与目标物质结合在一起，达到去除的目的；该方法在吸附毒素的同时对营养成分的损失也很大，所以目前已很少采用。

表1 不同种类中药材中ZEN污染情况Table 1 ZEN pollution in different types of Chinese medicinal materials

化学法是通过ZEN与碱、氧化剂等的作用，破坏毒素的活性基团，使其转化成其他无毒或低毒的物质。主要包括臭氧处理、双氧水处理、硫酸钠浸泡、维生素E处理法等。Xu等研究发现，臭氧能去除玉米粉中ZEN，并预测了臭氧处理后ZEN的化学结构变化。但化学法可能造成营养成分的破坏或化学试剂残留，甚至出现二次污染等不确定的危害，所以目前也很少采用化学法对ZEN进行脱毒。

微生物吸附法。微生物吸附是指其菌体细胞或者提取的大分子化合物与毒素分子结合，产生吸附作用，从而减轻或消除ZEN的毒性。研究发现，酵母细胞壁能很好地吸附ZEN，荣迪发现从酵母细胞壁中提取的酵母β-D-葡聚糖及其酯化制剂可以吸附部分ZEN。Krifaton等研究显示，酿酒酵母细胞壁中的β-D-葡聚糖类化合物在吸附ZEN时发挥主要作用。

微生物降解法。微生物降解法是利用微生物产生的代谢产物或者酶来破坏毒素分子，降解成无毒的产物。目前，关于ZEN生物降解已取得了一定的成果，发现了一些能降解ZEN的细菌、真菌及降解酶(表2)。潘丽婷等从麦粒中筛选出一株解淀粉芽孢杆菌对ZEN的降解能力高达95%。杨凡等从猪粪便中筛选出枯草芽孢杆菌，其ZEN分解率达95%。Molnar等从白蚁的尾肠里分离到了一株酵母菌可以将ZEN降解为无毒的产物。Takahashi-Ando等从粉红黏帚霉中分离纯化出一种水解酶ZHD101，可以将ZEN转化为无雌激素活性的产物。Yu等从不动杆菌SM04中克隆了一个过氧化物酶(Prx)基因，并在大肠杆菌中进行过表达，该酶在过氧化氢存在下能很好地消除ZEN的毒性。

通过NCBI可以下载到24种能降解ZEN的核酸序列，用MEGA7.0软件构建系统进化树(图1)，结果显示：芽孢杆菌属被报道较多的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌均是能高效降解ZEN的益生菌。

表2 ZEN生物脱毒法Table 2 ZEN biological detoxification method

图1 ZEN降解菌的系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree of ZEN-degrading bacteria

3 ZEN的生物降解机制

ZEN主要通过4个途径进行降解，包括C-6′-酮羰基的还原、C-2/C-4-OH的衍生化、内酯环的裂解以及二羟基苯环的裂解等。

ZEN内酯环C-6′-酮羰基位置上加氢生成玉米赤霉烯醇(zearalenol，ZEL)，包括α-ZEL和β-ZEL两个异构体(图2)。研究发现，灰色链霉菌、和班尼毛霉、根霉及酵母等菌株可将ZEN转化为α-ZEL与β-ZEL。但α-ZEL与β-ZEL均具有雌激素毒性，且α-ZEL的雌激素毒性比ZEN要大很多，因此视为无效脱毒。

(图3) Brodehl等研究发现，米曲霉和根霉能将ZEN转化为各种代谢物，包括ZEN-4-β-D-葡萄糖苷、ZEN-4-硫酸盐等霉菌毒素缀合物。但有研究发现，ZEN的C-2/C-4-OH衍生化的产物摄入体内后，由于体内的水解酶作用，有可能脱去衍生基团，从而释放出原型ZEN，具有一定的风险。

ZEN分子中的内酯环结构，裂解有3种方式(图4)。Takahashi-Ando等成功将分离纯化出的碱性水解酶ZHD101克隆到异源宿主(裂殖酵母和大肠杆菌)中，含有该基因的大肠杆菌可在24 h内将ZEN、α-ZEL和β-ZEL降解为无毒产物。其脱毒方式为先断裂ZEN的内酯键，使其环型结构打开，然后自发脱羧形成代谢产物1-(3，5-二羟苯基)-10′-羟基-1′反式-十一碳烯-6′-酮，代谢途径如图4中a所示。Vekiru等通过液相色谱-串联质谱和核磁共振等手段证明了毛孢酵母菌将ZEN降解为一种含羧基和羟基的新型降解产物，其代谢路径如图4中b所示，C-6′-酮羰基加一个氧原子形成一个新的内酯，然后在水解酶的作用下水解生成无毒降解产物。黄哲筛选出一株枯草芽孢杆菌发酵产生的酶作用于ZEN上C-6′-酮羰基后，使其脱去一分子碳和一分子氧，从而形成开环的降解产物(图4中c所示)。破坏ZEN内酯结构的降解产物没有类雌激素效应与生殖毒性，因此内酯环裂解是目前研究的较为有效的脱毒方式。

(图5) 二羟基苯环的裂解目前还处于研究阶段，Yu等筛选出不动杆菌SM04的氧化酶组分和过氧化物酶组分可高效降解ZEN，得到无苯环、含羧基结构的产物ZEN-1、ZEN-2。Sun等从发酵大豆中分离的黑曲霉菌株FS10可高效降解ZEN，并推测ZEN的苯环结构可能被破坏。破坏ZEN的二羟基苯环，使其降解成小分子物质，无论是从揭示新降解途径还是发现新ZEN降解酶方面，都为ZEN的生物脱毒提供了新的方向。

注：a=Candida tropicalis、Rhizopus stolonifer、Strephtomyces、Mucor bainieri图2 C-6′-酮羰基的还原Fig.2 C-6′-keto carbonyl reduction

注：a=Thamnidium elegans、Mucor bainieri、Rhizopus spp.、Aspergillus spp.图3 C-2/C-4-OH衍生化Fig.3 C-2/C-4-OH derivatization

注：a=Clonostachysor;b=Trichosporon;c=Bacillus图4 内酯环裂解Fig.4 Lactone ring cleavage

图5 ZEN二羟基苯环的裂解Fig.5 Cleavage of ZEN dihydroxybenzene ring

4 总结与展望

玉米赤霉烯酮(ZEN)类真菌毒素污染广泛，是人们身体健康的潜在威胁。如何有效预防和清除ZEN，已经受到重视，并取得了一定的效果和成绩。传统的物理、化学脱毒法均有其不足，生物脱毒法成为了研究的热点，针对ZEN，已筛选出了一些细菌、真菌及降解酶，并对ZEN的生物降解途径有了初步的认识，其中以裂解ZEN的内酯环和二羟基苯环途径最为有效，显示出利用生物降解ZEN的巨大潜力，为探索预防和清除真菌毒素污染提供了方向和范式。但是，真正能够应用于中药材脱毒的微生物或者酶仍然很有限，部分微生物存在降解能力不稳定、易退化、本身具有毒副作用等问题。

基于文献报道，笔者认为应该从以下方面进行深入研究：①需要加大分离、筛选具有ZEN降解能力益生菌的力度，发现筛选益生菌的规律。②深入研究ZEN降解产物的结构及降解机理，并结合分子生物学、组学原理，探索ZEN降解的生物途径、关键酶及其基因，为后续利用生物技术清除ZEN的污染做好准备。目前，对降解产物的化学结构及降解机理研究还不够深入，有些降解产物如α-ZEL、β-ZEL等仍具有雌激素毒性作用，有些降解方法如C-2/C-4-OH衍生化存在脱去衍生基团释放出原型ZEN的风险；目前真正有ZEN降解活性的酶就只有ZHD101及其同源性95%以上的同源物，除此之外，ZEN降解酶还存在分离纯化过程繁杂、产酶量低、酶活不稳定、酶作用条件苛刻等问题。③进一步了解中药材污染的途径和污染类型，以及中药材提取物中ZEN污染的情况；加强ZEN等毒素的检测方法研究，提高检测方法的适应性和降低检测成本，制定根及根茎类、果实种子类中药材中ZEN的检测方法和限度，提升中药材的质量标准。④结合中药材的贮藏等环节，研制清除ZEN污染的制剂，减少ZEN等污染造成的损失。

总之，一方面中药材的真菌毒素污染广泛存在，是影响中药材质量和应用的巨大隐患，另一方面预防和清除真菌毒素污染蕴含有许多的科学问题和巨大的经济、社会价值，值得投入更多的精力研究。