矢车菊-3-O-葡萄糖苷及其代谢物原儿茶酸对杂环胺诱导细胞损伤的修复机制

周 娜，张会敏，潘 飞，艾 欣，赵 磊，王成涛

（北京工商大学，食品营养与人类健康北京高精尖创新中心，北京市食品添加剂工程技术研究中心，北京 100048）

花色苷是一种广泛分布于植物中的天然色素，由花青素和糖分子通过糖苷键连接而成。现已知天然花青素多达20 种，其中矢车菊素、牵牛花色素、飞燕草素、锦葵色素、天竺葵素和芍药色素这6 种最为常见。大量研究表明，花色苷具有抗炎、抗癌、预防糖尿病及改善视力等功效。由于胃环境的pH值较低，花色苷进入人体后，在胃部保持稳定，能够通过胃黏膜，同时以糖苷形式被胃部快速吸收（大约20%～25%）。与胃部相反，肠道pH值接近于中性，花色苷在小肠内迅速代谢，并以原型或代谢物（乙醇醛、硫酸盐和甲基化衍生物）进入血液，或分泌到胆汁和尿液中。未被小肠吸收的花色苷进入结肠并发生实质性的结构变化，在生理条件下或在微生物作用下水解为花青素，进一步降解为简单的酚酸，如香草酸、儿茶酸、高香草酸等。矢车菊-3--葡萄糖苷（cyanidin-3-glucoside，C3G）是自然界中最为常见、含量最丰富的花色苷，其在人体内的主要代谢产物有原儿茶酸、3-甲基没食子酸、没食子酸、丁香酸和2,4,6-三羟基苯等，其中原儿茶酸含量最多。

杂环胺是肉类中的蛋白质经高温加工过程中产生的一种有毒的有机化合物。根据化学结构和产生机制不同，杂环胺可分为两大类，即氨基咪唑氮杂芳香烃类和氨基咔啉类，前者是由氨基酸、还原糖和肌酸或者肌酐在300 ℃的高温下缩聚而成，主要有2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑[4,5-]吡啶（2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-]pyridine，PhIP）、2-氨基-3-甲基咪唑[4,5-]喹啉（2-amino-3-methylimidazo[4,5-]quinoline，IQ）、2-氨基-3,8-二甲基咪唑[4,5-]喹喔啉（2-amino-3,8-dimethylimidazo[4,5-]quinoxal，MeIQx）等；后者则是由氨基酸和蛋白质在300 ℃的高温下裂解而产生，主要包括3-氨基-1,4-二甲基-5-吡啶并[4,3-]吲哚、3-氨基-1-甲基-5-吡啶并[4,3-]吲哚、2-氨基-9-吡啶并[2,3-]吲哚、2-氨基-3-甲基-9-吡啶并[2,3-]吲哚、2-氨基-6-甲基吡啶[1,2-:3’2’-]咪唑、2-氨基-二吡啶并[1,2-:3’2’-]咪唑等。大量流行病学调查研究发现，长期摄入杂环胺会增加直肠癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌等癌症的病发率，然而，家庭烹饪却难以完全避免杂环胺的产生。在已知的30多种杂环胺中，PhIP在肉制品热加工过程中最容易生成、含量最为丰富，IQ被国际癌症研究中心列为2A级致癌物，致癌作用最强。因此，从食源性物质中寻找抑制PhIP和IQ毒性的活性成分具有重要意义。

研究发现，一些天然多酚、黄酮类物质、化学合成物以及某些新鲜蔬果液等能够降低杂环胺的致突变性。Kalemba-Drożdż等通过彗星实验发现富含抗氧化物质（多酚、黄酮类、花青素、抗坏血酸）的浆果果汁能显著降低PhIP引起的氧化应激和DNA损伤。Jain等发现姜黄素可同时抑制PhIP诱导活性氧的生成和DNA加合物的形成，对DNA损伤有积极的改善效果；Akhtar等发现杨梅素能够有效地防止癌症前期单克隆丙种球蛋白病患者和健康人体DNA受到PhIP诱导损伤，这种保护作用可能归因于其通过上调肿瘤抑制基因的水平而发挥抗肿瘤活性。许多研究表明，C3G与其主要代谢物原儿茶酸（protocatechuic acid，PCA）具有抗氧化、抗炎、抗癌等生物活性。然而，目前鲜见C3G和PCA对PhIP和IQ毒性影响的作用机制研究。

杂环胺被消化吸收后，主要通过血液运输至肝脏进行代谢。杂环胺活性代谢物不仅可以与脂质和蛋白质结合，导致氧化应激、细胞损伤和生物功能性丧失，还可以与DNA形成杂环胺-DNA加合物引起遗传毒性，诱发细胞凋亡。细胞的凋亡受多种基因的调控，抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax参与调控细胞凋亡。人肝癌HepG2细胞被广泛应用于遗传毒理学等方面的研究，对于研究毒物作用机制有着重要意义。因此，本研究选用HepG2细胞，采用IQ和PhIP诱导细胞损伤，通过测定细胞存活率、细胞核形态和细胞周期来比较C3G和PCA对杂环胺损伤细胞毒性的影响，并测定DNA损伤相关基因（、、和）和凋亡相关基因（、、、、、和）的表达，初步探讨其修复机制，为杂环胺所致肝损伤防治和功能食品开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人肝癌细胞系（HepG2细胞）由中国协和医科大学细胞中心提供。

IQ、PhIP 加拿大TRC生物技术公司；C3G、PCA成都曼斯特生物技术有限公司；DMEM干粉培养基、青霉素-链霉素 美国Gibco公司；胎牛血清以色列Biological Industries公司；胰蛋白酶、细胞毒性实验（cell counting kit-8，CCK-8）试剂盒、噻唑蓝试剂、Hoechst33258染色剂 上海碧云天生物技术有限公司；TRIzol细胞裂解液 美国Ambion生物技术公司；反转录试剂盒、实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）试剂盒 北京天根生化科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

HDL超净工作台 北京东联哈尔仪器制造有限公司；Galaxy 170S恒温CO细胞培养箱 德国Eppondorf生物技术公司；SpectraMaxi3多功能酶标仪 美国Molecular Devices公司；ECLIPSE Ti倒置显微镜 日本Nikon公司；CFX96Toμch荧光定量PCR仪 美国Bio-Rad公司；BD Calibur流式细胞分析仪 美国Becton Dickinson公司；TDL-5-A低速台式离心机 上海安亭科学仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养

将HepG2细胞系用含体积分数10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和质量浓度100 μg/mL链霉素的DMEM培养液于5% CO、37 ℃培养箱中培养，使细胞贴壁生长。

1.3.2 HepG2细胞存活率的测定

实验分为对照组（正常培养的细胞）、IQ单独损伤组、PhIP单独损伤组、IQ+C3G组、IQ+PCA组、PhIP+C3G组、PhIP+PCA组。将处在对数生长期的细胞接种于96 孔板中，利用血球计数板调整密度至每孔5×10个/100 μL，5% CO、37 ℃孵育24 h，细胞全部贴壁后，给予IQ或PhIP（0、62.5、125、250、500 μmol/L）以确定合适的作用浓度，再分别用不同终浓度的C3G和PCA（0、100、200、400、500 μmol/L）进行干预，每组5 个复孔。孵育48 h后，加入10 μL CCK-8工作液，继续培养2 h。用酶标仪于570 nm波长处测各孔吸光度。根据下式计算细胞存活率。

1.3.3 Hoechst33258染色法观察细胞核形态

将生长状态良好的细胞接种于6 孔培养板中的无菌盖玻片上，37 ℃、5% CO条件下培养24 h，待细胞融合至约50%～80%。加入含有不同浓度的杂环胺培养液（IQ终浓度为250、500、1 000 μmol/L，PhIP终浓度为125、250、500 μmol/L），放入培养箱培养48 h；用预冷的乙醇溶液将细胞固定，于4 ℃过夜；洗净固定液，加入Hoechst33258染色液避光染色；制作载玻片并随机选取10 个非重叠视野置于400 倍的荧光显微镜下观察细胞核形态。

1.3.4 流式细胞仪检测细胞周期

将状态良好的细胞接种于60 mm的细胞培养皿中，24 h后加入IQ（500 μmol/L）或PhIP（125 μmol/L），随后分别加入400 μmol/L C3G或PCA，作用48 h后，加入1 mL 0.25%胰酶消化2～3 min，收集细胞于15 mL离心管中，1 000 r/min离心10 min，收集细胞，用4 ℃预冷的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.4、0.01 mol/L）清洗细胞2 次，再用200 μL PBS悬浮细胞，得到单细胞悬浮液，于体积分数70%乙醇溶液中4 ℃固定24 h；2 000 r/min离心10 min收集固定后的细胞，再用4 ℃预冷的PBS清洗3 次，得到的细胞用500 μL PBS悬浮得到细胞悬浮液，加入终质量浓度为25 μg/mL的RNaseA，37 ℃水浴40 min；加入26.3 μL质量浓度1 mg/mL的碘化丙啶（propidium iodide，PI）冰上避光染色30 min后，流式细胞仪检测每组细胞周期分布情况。

1.3.5 实时荧光qPCR

各组加样作用48 h后的细胞经胰酶消化后收集于离心管中，用4 ℃预冷PBS洗涤2 次，离心收集细胞沉淀。利用Trizol法提取细胞总mRNA，加入10 μL的焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate，DEPC）水溶解RNA，按照反转录试剂盒说明书进行cDNA合成。反转录反应体系：2 µL 10×反转录缓冲液、1 µL酶混合物、2 µL引物混合物、5 µL双蒸水，于42 ℃孵育15 min，95 ℃孵育3 min。以三磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，）基因作为内参基因，引物序列见表1。

表1 qPCR所用引物序列Table 1 Primer sequences used for qPCR

1.4 数据统计与分析

用SPSS Statistic 21软件进行单因素方差分析，结果以平均值±标准差表示。实验设定3～5 个平行组，每个实验重复不少于3 次，以＜0.05表示存在显著性差异。

2 结果与分析

2.1 IQ和PhIP对HepG2细胞存活率和细胞核形态的影响

选用不同浓度（0～500 μmol/L）的杂环胺诱导HepG2细胞48 h，CCK-8检测细胞存活率，筛选出建立体外细胞损伤模型的最佳IQ和PhIP诱导浓度。如图1所示，随着杂环胺处理浓度的不断增大，细胞的存活率均呈下降趋势。与对照组相比，IQ浓度为250 μmol/L和500 μmol/L时，细胞存活率分别下降至81.71%和70.68%；而PhIP浓度仅为62.5 μmol/L时，细胞存活率就已经下降至86.48%，当作用浓度增大为500 μmol/L时，细胞存活率可降至33.31%。当细胞存活率为90%以上时认为杂环胺在该浓度下无细胞毒性，而当细胞存活率低于60%时，细胞损伤严重难以恢复，结合前期研究报道，本实验选择500 μmol/L IQ以及125 μmol/L PhIP用于后续研究。

图1 IQ和PhIP对HepG2细胞存活率的影响Fig. 1 Effects of IQ and PhIP on the survival rate of HepG2 cells

采用Hoechst33258荧光染色法观察IQ和PhIP作用48 h后HepG2细胞核形态的变化。由图2可看出，对照组细胞核形态圆润清晰，荧光显色均匀弥散。而经过杂环胺处理的细胞，细胞核或者细胞质内出现了明亮并且浓密的荧光，说明经过药物处理后的细胞核发生明显变化，呈现核浓缩状态，染色质遭到破坏发生形变，即典型的凋亡细胞核状态，同时可看出浓缩细胞核数量随着药物浓度的增大而增加。

图2 IQ和PhIP对HepG2细胞核形态的影响（400×）Fig. 2 Effects of IQ and PhIP on the nucleus morphology of HepG2 cells (400 ×)

2.2 C3G和PCA对杂环胺损伤HepG2细胞存活率的影响

C3G和PCA对杂环胺损伤细胞存活率的影响如图3所示。IQ或PhIP单独处理后，HepG2细胞存活率均显著降至对照组的60%左右。由图3A可知，与IQ单独损伤组相比，100～500 μmol/L的C3G均能显著提高细胞存活率（＜0.05），而PCA仅在500 μmol/L时能够显著提高细胞存活率（＜0.05）。由图3B可知，与PhIP单独损伤组相比，100～500 μmol/L C3G均能显著提高细胞存活率（＜0.05），而PCA仅在200 μmol/L和400 μmol/L时能够显著提高细胞存活率（＜0.05）。因此，C3G对杂环胺损伤HepG2细胞的保护作用效果要比PCA更好。

图3 C3G和PCA对IQ（A）和PhIP（B）损伤HepG2细胞存活率的影响Fig. 3 Effects of C3G and PCA on the survival rate of HepG2 cells injured by IQ (A) and PhIP (B)

2.3 C3G和PCA对杂环胺损伤HepG2细胞周期的影响

为了探究C3G和PCA对杂环胺诱导的HepG2细胞增殖能力变化的影响，运用流式细胞术对细胞周期的分布情况进行了检测。图4A～C显示，与对照组相比，IQ诱导HepG2细胞的G0/G1期和S期细胞比例分别显著和极显著下降（＜0.05、＜0.01），而G2/M期细胞比例极显著增加（＜0.01），这表明IQ（500 μmol/L）可使HepG2细胞发生G2/M期阻滞和DNA损伤，使细胞产生不利于有丝分裂的信号。与IQ单独损伤组相比，C3G和PCA均能够诱导G0/G1期细胞比例显著或极显著降低（＜0.05、＜0.01），S期细胞比例升高，说明加入C3G或PCA可使HepG2细胞发生明显的S期阻滞，对DNA损伤有改善效果。

如图4D～F所示，与对照组相比，PhIP诱导HepG2细胞的G0/G1期细胞比例极显著升高（＜0.01），S期细胞比例极显著下降（＜0.01），而G2/M期细胞比例未发生明显改变。这表明PhIP（125 μmol/L）可使细胞产生G0/G1期阻滞，无法进入S期进行DNA的复制，影响了正常的细胞周期进程，使细胞修复损伤或发生凋亡。与PhIP单独损伤组相比，C3G和PCA均能够诱导G0/G1期细胞比例显著或极显著降低（＜0.05、＜0.01），S期细胞比例极显著上升（＜0.01），说明加入C3G或PCA后可促进细胞由G1期进入S期，促进细胞体外生长增殖能力，对125 μmol/L PhIP引起的细胞周期变化有积极改善作用。

图4 流式细胞术检测C3G和PCA对杂环胺损伤HepG2细胞周期的影响Fig. 4 Effects of C3G and PCA on cell cycle of HepG2 cells damaged by heterocyclic aromatic amines

2.4 C3G和PCA对杂环胺损伤HepG2细胞的DNA损伤和细胞凋亡相关基因表达的影响

C3G和PCA对杂环胺诱导HepG2细胞DNA损伤基因mRNA表达的影响如图5所示。与对照组相比，IQ显著提高了4 种DNA损伤相关基因的表达量；PhIP显著提高了和基因的表达量（＜0.05）。由此说明IQ和PhIP可以通过提高DNA损伤相关基因的表达水平从而造成HepG2细胞的损伤。与IQ单独损伤组相比，C3G可显著降低、和基因的mRNA表达水平（＜0.05）（图5A），PCA可显著降低GADD45α和基因的mRNA表达水平（＜0.05）（图5B）。但C3G和PCA对PhIP诱导的HepG2细胞和基因的mRNA表达水平无显著影响（＞0.05）（图5C、D），说明两者可能通过其他途径减轻PhIP对细胞产生的不利影响。Liu Wei等发现，和基因和蛋白的表达水平在紫外照射HepG2细胞12 h后明显升高，而经过一定浓度的蓝莓花青素干预后，两者的表达量显著降低，这与本实验C3G干预IQ造成DNA损伤后的变化趋势相同，说明C3G和PCA对IQ造成的DNA损伤有改善作用。但加入PCA和C3G后，基因mRNA表达水平变化趋势有明显差异，其原因仍待查明，推测基因参与多条通路，与其他通路中的作用靶点有关。

图5 C3G和PCA对杂环胺诱导HepG2细胞DNA损伤相关基因mRNA表达的影响Fig. 5 Effects of C3G and PCA on the mRNA expression of DNA damagerelated genes in HepG2 cells induced by heterocyclic aromatic amines

C3G和PCA对杂环胺诱导HepG2细胞凋亡相关基因mRNA表达的影响如图6所示。与对照组相比，经IQ和PhIP处理的HepG2细胞的促凋亡基因、、、的mRNA表达量显著提高（＜0.05），PhIP处理的HepG2细胞的基因表达量无显著变化（＞0.05），说明IQ和PhIP能促进HepG2细胞发生凋亡，IQ和PhIP作用后亦能使抑凋亡基因的mRNA表达量显著上调（＜0.05），这与Pezdirc等报道的250 μmol/L IQ作用HepG2细胞使基因表达量显著下调，基因表达量上调的趋势不同，其原因仍需进一步探究。与IQ单独损伤组相比，C3G和PCA显著降低了促凋亡基因的表达水平（＜0.05），进一步显著提高了抑凋亡基因和的mRNA表达水平（＜0.05）（图6A、B），由此可得出，C3G和PCA可显著下调IQ引起的促凋亡基因的过表达，可以降低IQ诱导的细胞毒性和细胞凋亡。吴实在研究C3G修复紫外线照射后的细胞损伤时也发现，C3G可下调紫外线氧化损伤后基因的表达量，上调基因表达量，以此实现对损伤细胞的修复作用。与PhIP单独处理组相比，加入C3G干预后，促凋亡基因除和基因mRNA表达水平显著降低外（＜0.05），其他促凋亡基因、、mRNA表达水平均显著升高（＜0.05）（图6C）；加入PCA干预后，促凋亡基因、、基因mRNA表达水平显著降低（＜0.05），而其他促凋亡基因、基因mRNA表达水平仍显著升高（＜0.05）（图6D）。上述研究表明，C3G和PCA能够使细胞凋亡保持在合适的水平，当PhIP诱导细胞凋亡程度较轻时，可降低细胞凋亡从而使细胞恢复正常状态；而当PhIP使细胞凋亡严重至不可修复时，细胞继续增殖容易诱发突变，C3G和PCA则促进这部分细胞凋亡，从而减少PhIP诱发的突变。

图6 C3G和PCA对杂环胺诱导HepG2细胞凋亡相关基因mRNA表达的影响Fig. 6 Effects of C3G and PCA on the mRNA expression of apoptosisrelated genes in HepG2 cells induced by heterocyclic aromatic amines

3 结 论

本实验通过杂环胺诱导建立HepG2细胞肝损伤模型，比较C3G和PCA对杂环胺损伤细胞毒性的影响，并初步探讨其修复机制。结果表明，IQ和PhIP能显著降低细胞存活率并使细胞核发生皱缩破坏；C3G和PCA能够显著提高杂环胺损伤细胞的存活率，并对杂环胺引起的细胞周期变化有积极改善作用；C3G和PCA对IQ造成的DNA损伤和细胞凋亡有改善作用，对PhIP造成的DNA损伤也有一定的修复效果，但当PhIP损伤严重至无法逆转时，C3G和PCA可促进细胞凋亡，降低癌变发生几率。与国内外现有研究相比，本研究首次系统研究并比较了C3G及其代谢产物PCA对杂环胺诱导细胞损伤的修复作用及潜在作用机制，同时揭示了C3G可通过母体和代谢物形式共同发挥其生物活性。本研究可为日常饮食中减轻杂环胺对人体健康的危害提供理论指导，并促进花色苷资源的开发与应用。