牛肉干法成熟过程挥发性风味物质的变化规律

刘 梦，张顺亮，臧明伍，赵 冰，黄卉佳，朱 宁，李 素，吴倩蓉，刘博文，赵 燕，乔晓玲，王守伟

（中国肉类食品综合研究中心，北京 100068）

肉的成熟是指将新鲜或冷冻的肉类放在特定温度、湿度条件下贮藏一段时间的过程。目前，常见的成熟方式有湿法成熟和干法成熟。湿法成熟是将肉放在真空包装袋中，在运输和销售的过程中完成成熟过程。干法成熟是将肉放在－1.5～4 ℃，相对湿度为85%条件下，贮藏一段时间以完成成熟过程。随着成熟时间的延长，干法成熟的肉表面会失水，同时会被氧化，有的肉表面还会有微生物附着。而湿法成熟的肉因其被包裹在真空袋中，有效抑制了牛肉氧化和微生物生长。但是，大量研究表明，干法成熟的牛肉所产生的风味优于湿法成熟，这也是近几年干法成熟肉深受消费者欢迎的原因之一。

近年来，许多学者对干法成熟和湿法成熟牛肉的感官进行了比较分析。大多数研究表明干法成熟牛肉的感官评分更高，且其具有更浓的牛肉味和烧烤味，也有部分研究认为干法成熟的牛肉鲜味和油炸味较浓。干法成熟牛肉的挥发性风味物质的形成主要分为2 种途径，一是脂质氧化与降解，二是氨基酸与还原糖之间发生的美拉德反应。目前，针对干法成熟牛肉风味的研究多集中于对比不同成熟方式对牛肉风味等品质的影响，而关于干法成熟过程牛肉挥发性风味物质变化规律的研究较少，不能对干法成熟牛肉加工形成有效参考。

本研究以牛上脑肉为原料，采用电子鼻、气相色谱-嗅闻-质谱联用仪等分析仪器和方法，研究干法成熟过程牛肉挥发性风味物质的变化规律，以探究干法成熟过程不同阶段牛肉挥发性风味物质的相似性及差异，为牛肉干法成熟技术的开发与应用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛上脑肉 河北福成五丰食品股份有限公司；2-甲基-3-庚酮（纯度99%）、C～C系列正构烷烃 美国西格玛公司。

1.2 仪器与设备

牛肉干法成熟设备由中国肉类食品综合研究中心自主研发；PEN3便携式电子鼻 德国Airsense公司；TRACE 1310型气相色谱-TSQ 8000型质谱仪 美国Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

将牛上脑肉在4 ℃冷库中解冻至中心温度达到0 ℃后，将其分割成大小约为25 cm×15 cm×15 cm均匀的肉块。放入干法成熟设备中进行成熟，成熟条件为4 ℃、相对湿度85%，成熟时间为28 d。具体实验条件见表1。

表1 实验条件Table 1 Experimental conditions for each group

1.3.2 电子鼻检测

准确称取1.5 g样品于样品瓶中，50 ℃平衡5 min，使用电子鼻进行检测。传感器相应信号在68 s后趋于稳定，选取70～75 s进行分析，每组样品做5 次平行。

1.3.3 挥发性风味物质的固相微萃取

固相微萃取方法参考文献[8]。称取（3.00±0.05）g样品置于固相微萃取小瓶中，加入1 μL 0.816 μg/μL 2-甲基-3-庚酮标品，旋紧盖子，放入50 ℃水浴锅中平衡10 min，然后将固相微萃取针头插入瓶中，于顶空状态吸附40 min。

1.3.4 挥发性风味物质的测定

气相色谱-质谱方法参考文献[9]。

气相色谱条件：TG-Wax MS极性柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；载气为高纯氦气（纯度＞99.99%）；流速1.0 mL/min；采用不分流模式，保持2 min。升温程序：柱起始温度40 ℃，保持3 min，之后以5 ℃/min速率升温到200 ℃，保持1 min，再以8 ℃/min速率升温到220 ℃，保持3 min。进样口温度250 ℃。

质谱条件：电子电离源；传输线温度230 ℃；电子能量70 eV；离子源温度280 ℃；质量扫描范围40～600 u，全扫描模式。

1.3.5 挥发性风味物质分析

定性分析：根据所得谱图与NIST数据库提供的谱图对风味物质定性分析，选取正反匹配度均大于800的化合物。通过系列正构烷烃计算待测化合物保留指数（retention index，RI），并与文献进行比对。RI按式（1）计算：

式中：为样品的保留时间/min（在正构烷烃C和C之间）；t、t分别为正构烷烃C、C的保留时间/min。

定量分析：根据内标2-甲基-3-庚酮的含量及峰面积对挥发性风味物质进行半定量分析，按式（2）计算：

式中：C为待测化合物含量/（µg/kg）；为内标物质量浓度（0.816 µg/µL）；为内标物进样体积/µL；S为待测化合物的峰面积/（AU·min）；为内标物峰面积/（AU·min）；为样品取样质量/kg。

1.3.6 嗅闻检测

参考文献[10]的方法。样品中挥发性风味物质经气相色谱分离后分别进入质谱检测器和嗅闻检测器，分流比为1∶1，嗅闻传输线温度为200 ℃。选取3 名嗅觉灵敏并经过专业培训的人员在嗅闻口进行嗅闻，记录闻到的气味、保留时间、气味特征和气味强度。强度分为5 个等级（1＝气味非常微弱、2＝气味微弱、3＝气味中等、4＝气味强烈、5＝气味非常强烈）。每种风味化合物的气味描述以及时间需由至少2 名评价员确认一致，则将该描述记为最终实验结果。

1.3.7 相对气味活度值（relative odor activity value，ROAV）计算

参考文献[11]，按式（3）计算：

式中：C为挥发性风味物质含量/（µg/kg）；T为该挥发性成分嗅觉阈值/（µg/kg）；为气味贡献最大挥发性风味物质的阈值/（µg/kg）；为气味贡献最大挥发性风味物质含量/（µg/kg）。

1.4 数据处理

使用Excel对数据进行平均值、标准差等计算；使用Origin 8.0绘制柱状图；使用SPSS 21.0进行差异显著性分析，＜0.05，差异显著，＜0.01，差异极显著；使用Heatmapper网络在线软件进行二维聚类分析，并绘制热图。

2 结果与分析

2.1 牛肉干法成熟过程电子鼻的线性判别分析结果

图1 电子鼻LDAFig. 1 LDA plot of electronic nose data

由图1可知，LD1和LD2的贡献率分别为95.71%和2.34%，总贡献率为98.05%。图中各组样品间无重叠区域，说明线性判别分析（linear discriminant analysis，LDA）分析可将不同干法成熟阶段的牛肉区分开。0 d和7 d牛肉在LD1上区别不明显，在LD2上区别明显，LD1代表了样品95.71%的特征信息，说明0 d和7 d牛肉的挥发性风味变化较小。14、21 d和28 d牛肉与0 d和7 d牛肉在LD1上区别明显，说明干法成熟14 d以后牛肉的挥发性风味发生了显著性变化。

2.2 牛肉干法成熟过程挥发性风味物质的组成分析

图2 挥发性风味物质含量及数量Fig. 2 Contents and types of volatile flavor compounds in different samples

由图2可知，未经成熟的牛肉其挥发性风味物质种类最少，为39 种。随着干法成熟的进行，检测到的挥发性风味物质种类呈先上升后下降的变化趋势，分别为46、50、53 种和45 种。这可能是因为干法成熟过程牛肉蛋白质和脂肪被内源酶逐渐降解，使得挥发性风味物质的种类增多。成熟28 d时，牛肉中酯类物质种类减少（成熟21 d时为11 种，成熟28 d时为5 种），这可能是因为随着成熟的进一步进行，酯类物质发生降解，导致其种类减少，进而导致成熟28 d时挥发性风味物质种类减少。未经成熟的牛肉其挥发性风味成分含量最低，为（847.13±9.10）µg/kg。而随着成熟的进行，挥发性风味物质含量呈上升趋势，分别为（1 059.70±11.29）、（1 218.05±3.19）、（1 383.95±37.95）µg/kg和（2 719.27±44.19）µg/kg，其中成熟28 d时，挥发性风味物质的含量达到最大，是未经干法成熟牛肉挥发性风味物质含量的3.21 倍，是成熟21 d挥发性风味物质含量的1.96 倍。说明随着干法成熟的进行，挥发性风味物质的含量逐渐增多。其中，醇类物质和酮类物质含量整体呈上升趋势；酸类物质呈先下降后上升的趋势；醛类物质呈上升趋势；酯类物质呈先上升后下降的趋势。这可能是因为成熟前期牛肉内源酶将脂肪和蛋白质降解，同时脂肪发生氧化，生成醇类、酮类、醛类和酯类物质，导致这些物质含量上升。随着成熟的进行，醇类物质氧化生成酮类物质，醇类物质含量小幅度减少，而伴随着脂肪继续氧化，醇类物质后期含量增加；同时蛋白质降解产物发生Strecker反应，以及微生物的作用，导致醛类物质在成熟后期含量增加；而酮类物质主要由脂肪氧化、醇类物质氧化和酯类物质降解得到，在成熟过程中其含量处于波动变化状态，同时由于酯类物质的降解，导致后期酯类物质含量减少；酸类物质初期含量较高，这可能是由于所使用的原料肉未经成熟产酸造成的，在成熟过程中相当于先进行了成熟产酸过程，导致酸类物质含量下降，后期由于氨基酸Strecker反应、酯类物质降解以及酵母菌的生长导致酸类物质含量上升。

2.3 牛肉干法成熟过程挥发性风味物质的含量变化

图3 挥发性风味物质含量变化热图及聚类分析Fig. 3 Cluster heatmap of volatile flavor compounds

为直观表达不同成熟时间样品中挥发性风味物质含量的变化，对检测到的挥发性风味物质的含量变化进行热图分析，如图3所示。红色越深代表该挥发性风味物质含量越高，蓝色越深代表该挥发性风味物质含量越低。有31 种挥发性风味物质随着成熟时间的延长含量增加，如异丁醇、苯甲醛、十三烷、十四烷、3-辛酮、2-乙基-1-己醇、芳樟醇、苯甲醇、萘、正戊酸、2,3-丁二酮、2-庚酮、2-壬酮、正己酸乙酯、辛酸乙酯等。异丁醇被认为是酿酒酵母发酵果酒中的重要香味物质。苯甲醛具有杏仁味和焦糖味，可由微生物利用支链氨基酸降解产物得到，在霉菌发酵的食品中常被检出，说明成熟后期牛肉表面微生物的生长对牛肉风味的形成具有促进作用。2,3-丁二酮、2-庚酮、3-辛酮、正己酸乙酯、辛酸乙酯这些具有黄油味、肥皂味、水果味、脂肪味等气味的风味物质气味阈值较低，可能对成熟后期牛肉的风味产生较大的影响。

有10 种风味物质含量逐渐减少或在后期未被检测到，主要为醇类、酸类和烃类，如正戊醇、反式-2-辛烯-1-醇、正己酸、十五烷等，随着成熟的进行这些物质易被氧化或相互反应生成酯类等物质，因而其在成熟过程中含量逐渐降低。

有43 种风味物质含量呈先上升后下降的变化趋势，如丙位辛内酯、十一醇、异戊醇、1-辛烯-3-醇、1-壬醇、4-异丙基甲苯、仲辛酮、异戊酸乙酯、乙酸异戊酯、癸酸乙酯、乙醇、壬醛、癸醛、十二醛等，其中异戊醇由亮氨酸生成，并带有香蕉果香，是韩国果酒和日本米酒里重要的香味物质；壬醛具有哈喇味、鱼腥味，是油酸的氧化产物；1-辛烯-3-醇是亚油酸的氢过氧化物降解产物，具有蘑菇香气和草香味。成熟过程中内源酶分解蛋白质生成小分子物质，如氨基酸等，因此由氨基酸参与形成的风味物质在成熟一段时间后才会被检测出；油酸是单不饱和脂肪酸，通常在多不饱和脂肪酸被氧化后才会被氧化；而亚油酸氢过氧化物的形成和降解也需要在成熟过程中进行，因此以这些物质为前体物的风味物质在成熟过程进行一段时间后才会生成，因而这些物质的含量出现上升的趋势，后期随着成熟的进行，醇类物质被氧化导致其含量下降。

2.4 牛肉干法成熟过程中挥发性风味物质的聚类分析

如图3所示，不同成熟时间牛肉风味物质存在差异。未经成熟和成熟7 d牛肉在最小水平上形成一个小类，说明两者之间具有较大的相似性；成熟14 d和成熟21 d的牛肉在最小水平上也形成一个小类，说明两者之间同样具有相似性；随着欧式距离的增大，这两个小类聚为一类，说明未经成熟和成熟7 d与成熟14 d和成熟21 d牛肉之间具有较大的差异；当欧式距离再次增大时，成熟28 d的牛肉才与其他成熟样品聚为一类，说明成熟28 d牛肉其挥发性风味物质差异最大。由此可以大致将成熟过程挥发性风味物质的变化分为3 个阶段：成熟7 d为第1阶段；成熟7 d～21 d为第2阶段；成熟21～28 d为第3阶段。这与Watanabe等的研究结果一致。

2.5 牛肉干法成熟过程中挥发性风味物质的ROAV

ROAV可以衡量挥发性风味物质中对整体风味有总要贡献的物质，一般认为ROAV越大，该物质对总体风味的贡献越大。ROAV不小于1的物质为关键风味物质，ROAV介于0.1至1之间的物质对总体风味有重要的修饰作用。表2列出了牛肉干法成熟过程中ROAV不小于1的挥发性风味物质及其含量。由表2可知，异戊醇、2-庚醇、1-辛烯-3-醇、1-壬醇、壬醛、邻-异丙基苯、2,3-丁二酮、正己酸乙酯在成熟过程中对牛肉整体风味贡献较大，这些物质主要具有威士忌酒、麦芽味、烧焦味、蘑菇味、脂肪味、青草味、柑橘味、黄油味、苹果皮味及果香味。癸醛、十二醛、2-庚酮、3-辛酮随着成熟时间延长，其ROAV越大，这些物质主要由脂肪氧化得到，具有脂肪味、肥皂味和黄油味，说明成熟过程中脂肪发生氧化，促进牛肉风味物质的形成。值得注意的是，异戊酸乙酯、癸酸乙酯和丙位辛内酯在成熟中期被检测到，而在前期和后期未被检测到，这可能是因为成熟前期，脂肪水解产生的脂肪酸与脂肪氧化产生的醇类物质发生酯化反应生成酯类物质；后期酯类物质降解，与氨基酸反应生成其他风味物质，导致其未被检测出。

表2 成熟过程中挥发性风味物质含量及ROAVTable 2 Contents and ROAV of volatile flavor compounds in beef during the dry-aging process

2.6 牛肉干法成熟过程中挥发性风味物质的嗅闻结果

表3 GC-O法鉴定成熟过程中牛肉的香气特征Table 3 Aroma characteristics of beef during the dry-aging process by determined by GC-O

由表3可知，牛肉成熟过程中分别检测到7、9、11、11 种和9 种香气成分。其中，异戊醇、2,3-丁二酮和正乙酸乙酯在整个成熟过程中香气强度均较大，呈酒香、麦芽香、黄油味、苹果皮和水果味，奠定了牛肉成熟过程中的风味基调。而在未经成熟的牛肉中乙酸异戊酯的香气强度同样较大，呈香蕉味；成熟7～21 d牛肉中检测到了癸酸乙酯和丙位辛内酯，其中癸酸乙酯的香气强度较大，呈葡萄味；除此之外，成熟14 d牛肉中异戊酸乙酯和乙酸异戊酯的香气强度较大，呈香蕉味和水果味，且异戊酸乙酯是成熟14 d特有的关键风味物质；成熟21 d牛肉中2-庚酮的香气强度较大，呈肥皂味；成熟28 d的牛肉中癸醛和十二醛的香气强度较大，呈脂肪味、青草味和肥皂味。与ROAV的检测结果一致。

对比成熟过程中牛肉的香气特征和ROAV可以发现，未经成熟的牛肉中异戊醇、2,3-丁二酮、乙酸异戊酯和正己酸乙酯是其关键风味物质；成熟7 d的牛肉中异戊醇、正己酸乙酯和癸酸乙酯是其关键风味物质；成熟14 d牛肉中异戊醇、异戊酸乙酯、乙酸异戊酯、正己酸乙酯和癸酸乙酯是其关键风味物质；成熟21 d牛肉中异戊醇、2-庚酮、正己酸乙酯和癸酸乙酯是其关键风味物质；成熟28 d牛肉中异戊醇、癸醛、十二醛和正己酸乙酯是其关键风味物质。从整体风味看，随着成熟的进行，成熟前期关键风味以果香味为主，同时具有酒香味、麦芽味和黄油味；而成熟后期由于脂肪氧化的加重，关键风味以脂肪味为主，兼具果香味、酒香味和麦芽味。这与Campo等的研究结果一致。

3 结 论

通过电子鼻结合气相色谱-嗅闻-质谱联用仪对牛肉干法成熟过程挥发性风味物质的变化进行研究。结果表明，不同成熟阶段牛肉挥发性风味物质有较好的区分度；随着成熟时间的延长，风味物质含量显著上升，在成熟28 d时，其挥发性风味物质含量是未经成熟牛肉的3.21 倍，说明干法成熟有利于牛肉风味的形成；通过风味物质的聚类分析可将成熟过程大致分为3 个阶段，成熟0～7 d为第1阶段，该阶段牛肉风味差别不大；成熟14～21 d为第2阶段，此阶段与第1阶段挥发性风味具有较大差异，但阶段内挥发性风味差异不大；成熟28 d为第3阶段，此阶段与前两个阶段挥发性风味物质含量变化最大；通过ROAV和香气特征分析，发现异戊醇和正己酸乙酯是整个成熟过程中的关键风味物质，呈酒香味、麦芽味和果香味。同时每个成熟时期存在其他关键风味物质，癸醛和十二醛在成熟28 d时被检测为新的关键风味物质，使得牛肉整体风味以脂肪味为主。

综上，本实验通过对干法成熟过程牛肉挥发性风味物质的变化分析，初步明确了干法成熟过程中挥发性风味物质的变化规律，后续将对成熟过程中蛋白质、脂肪及微生物的变化进行分析，为牛肉成熟技术的开发和应用提供理论依据。