基于UPLC-MS/MS的3 个李品种果实初生代谢物分析

张 琴，黄世安，林 欣，罗登灿，彭俊森，朱守亮，董晓庆,*

（1.贵州大学农学院，贵州省果树工程技术研究中心，贵州 贵阳 550025；2.贵州省果树蔬菜工作站，贵州 贵阳 550025）

李（L）属于蔷薇科（Rosaceae）李属（）植物，是多年生核果类水果，果肉酸甜可口且营养价值高，富含多种糖、有机酸、氨基酸、维生素、膳食纤维和矿物质等多种营养成分，具有治疗疾病、心管疾病、增强免疫、抗氧化等多种生理功能。与其他果实相比，李果实中的膳食纤维、酚类物质含量和抗氧化活性均相对较高。

植物初生代谢物包括糖类、氨基酸、核苷酸、有机酸等物质，是植物生长发育和繁殖等生命活动必不可少的基础物质和能量来源，主要作用是参与细胞的能量代谢。糖、有机酸和氨基酸等初生代谢物含量是评价果实品质的重要指标。代谢组学发展至今，其研究手段更加高效准确，在环境科学、毒理学研究、食品与营养学、疾病诊断、植物代谢研究等学科领域得到广泛应用。Francini等利用代谢组学对不同品种的苹果干进行分析，发现儿茶素、表儿茶素和绿原酸等酚类物质是区别不同品种的重要物质，与苦涩味密切相关。方贤胜等利用超高效液相色谱-串联质谱（ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）技术对浅黄色和紫色核桃内种皮代谢物进行了研究，为核桃内种皮中化学物质表征和功能成分研究提供了参考。Wang Dandan等基于广泛靶向代谢组学技术对黑芝麻中的营养成分及其在中药中发挥作用的相关代谢物进行了鉴定。Zou Shicheng等利用广泛靶向代谢组学鉴定了枇杷的关键味觉成分，为枇杷味觉变异的潜在代谢原因提供了新的见解。王梦琪等采用UPLC-MS/MS技术分析比较了不同香型绿茶非挥发性成分差异。但是运用代谢组学技术分析不同品种李果实初生代谢成分及其差异的研究尚鲜见报道。

本研究以蜂糖李、空心李和脆红李果实为研究材料，采用UPLC-MS/MS技术，从差异代谢物的角度着手，对3 个李品种果实的初生代谢物进行定性定量分析，揭示其氨基酸及其衍生物、有机酸和糖类等物质组成及各成分差异，旨在为李果实中的化学物质表征和功能成分研究提供参考，对提高李产量以及增强果实品质有非常重要的作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

以蜂糖李（‘Fengtang’，FTL）、空心李（‘Kongxin’，KXL）、脆红李（Lindl. c.v‘Cuihong’，CHL）的果实为实验材料，其中，蜂糖李于2020年6月27日采自贵州省镇宁县六马蜂糖李种植农民专业合作社果园（105.52 E，25.37 N），空心李于2020年7月12日采自贵州省沿河土家族自治县农民专业合作社果园（108.32 E，28.32 N），脆红李于2020年8月24采自贵州省贵阳市乌当区贵州省农业科学院果树研究所百宜实验基地（106.59 E，26.48 N）。采后4 h内运回贵州大学园艺实验室，挑选大小、色泽及成熟度一致（8 成熟）、无机械损伤的果实进行处理。

甲醇、乙腈（均为色谱纯） 德国Merck公司；二甲基亚砜 美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 仪器与设备

Scientz-100F冻干机 宁波新芝公司；MM 400研磨仪 德国Retsch公司；Nexera X2超高效液相色谱日本岛津公司；4500 QTRAP串联质谱 美国应用生物系统公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

将蜂糖李、空心李、脆红李果实去皮，各3 个生物学重复，迅速置于液氮中，随后转移到－80 ℃超低温冰箱中保存备用。对超低温冷冻保存的3 组供试样品放置于冻干机中进行真空冷冻干燥；研磨仪研磨（30 Hz，1.5 min）至粉末状；称取100 mg的粉末，溶解于1.2 mL 70%甲醇溶液提取液中；每30 min涡旋一次，每次持续30 s，共涡旋6 次，置于4 ℃冰箱过夜；12 000 r/min离心10 min后，吸取上清液，用0.22 μm微孔滤膜过滤样品，并保存于进样瓶中，用于UPLC-MS/MS分析。

1.3.2 UPLC-MS/MS分析

利用UPLC-MS/MS联用仪对样本进行分析。

UPLC条件：SB-C色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 µm）；流动相：A相为超纯水（加入0.1%的甲酸），B相为乙腈（加入0.1%甲酸）；洗脱梯度：0.0～9.0 min，95%～5% A、5%～95% B，维持1 min；10.0～11.10 min，5%～95% A、95%～5% B，并平衡至14 min；流速0.35 mL/min；柱温40 °C；进样量4 μL。

MS条件：电喷雾离子源温度550 ℃；离子喷雾电压5 500 V；离子源气体I、气体II和帘气分别设置为50、60、25 psi，碰撞诱导电离参数设置为高。三重四极杆扫描使用多反应检测模式，并将碰撞气体（氮气）设置为中等。在三重四极杆中，每个离子对是根据优化的去簇电压和碰撞能进行扫描检测。

1.3.3 质控（quality control，QC）样本

QC样本是由所有样本提取物等量混合制备而成（mix），3 个重复。在每10 个检测分析样本中插入一个QC样本，以监测分析过程的重复性。

1.4 数据处理

基于迈维（武汉）生物技术有限公司自建MWDB数据库，根据二级谱信息进行物质定性，通过三重四极杆质谱的多反应监测模式对代谢物定量。获得不同样本的代谢物质谱分析数据后，对所有物质质谱峰进行峰面积积分，并对其中同一代谢物在不同样本中的质谱出峰进行积分校正。利用软件Analyst1.6.3处理质谱数据。采用主成分分析（principal component analysis，PCA）、聚类分析对代谢物进行多元统计分析，根据正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squaresdiscriminant analysis，OPLS-DA）预测模型的稳定可靠性，同时利用多维统计变量投影重要性（variable importance in projection，VIP）值、单维统计值及差异倍数（fold change，FC）筛选差异代谢物。对差异显著的代谢物进行归一化处理，通过R软件中的pheatmap程序对蜂糖李、空心李和脆红李的差异代谢物进行聚类分析并绘制热图，利用京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）数据库对相应差异代谢物进行代谢通路分析。

2 结果与分析

2.1 3 个李品种果实初生代谢物总体分析

如图1所示，QC样品总离子流图的基线稳定，其重复性好，峰分离度高。

图1 QC样品总离子流图Fig. 1 Total ion current chromatograms of quality control samples

表1 3 个李品种果实的初生代谢物数量统计Table 1 Statistics of primary metabolites in three varieties of plum

在3 个李品种果实中，共检测到12 类307 种初生代谢物，如表1所示，包括74 种氨基酸及其衍生物、55 种有机酸、41 种核苷酸及其衍生物、40 种游离脂肪酸、35 种糖类、20 种溶血磷脂酰胆碱、12 种维生素、12 种醇类、10 种溶血磷脂酰乙醇胺、6 种甘油酯、1 种磷脂酰胆碱及1 种鞘脂。3 个李品种果实检测到的共有代谢物290 种，有17 种代谢物未在3 个品种中都检测到，分别是6 种有机酸（磷酸二乙酯、2-羟基丁酸、2-羟基肉桂酸*、乙基丙二酸、珀酸单甲酯、2-呋喃甲酸），4 种核苷酸及其衍生物（2-氨基嘌呤、环-3’,5’-腺嘌呤核苷酸、2’-脱氧鸟苷、次黄嘌呤），3 种氨基酸及其衍生物（-甲基甘氨酸、-乙酰--亮氨酸、-苯乙酰甘氨酸），2 种溶血磷脂酰胆碱（溶血磷脂酰胆碱15:1、溶血磷脂酰胆碱16:2），1 种糖类（松三糖--鼠李糖苷）和1 种维生素（抗坏血酸（VC））。其中，在空心李中检测到了特有的代谢物质环-3’,5’-腺嘌呤核苷酸，脆红李中检测到了溶血磷脂酰胆碱16:2，这2 种物质在蜂糖李果实内并没有检测到。表明不同品种李果实的初生代谢物存在差异。

空心李特有代谢物质环-3’,5’-腺嘌呤核苷酸可以作为其特征成分，是一类环状核苷酸，在植物细胞分化和分裂的过程中起着重要的调控作用。脆红李特有代谢成分溶血磷脂酰胆碱16:2，是溶血磷脂酰胆碱的一种，广泛存在于人体细胞内外的一类具有多种生理功能的生物活性信号分子。其含量变化与疾病类型、疾病严重程度密切相关，在临床病理研究、疾病诊断及预防等方面发挥着重要作用。

2.2 PCA结果

图2 3 组样品PCA得分图（A）和相关性图（B）Fig. 2 PCA score plot (A) and correlation heatmap (B) of three sets of samples and quality control

对蜂糖李、空心李、脆红李进行PCA，了解各组样本之间的总体代谢差异和组内样品之间的变异度大小。如图2所示，PC1和PC2的贡献率分别为33.84%和24.88%，各组之间代谢物分离趋势明显，表明蜂糖李、空心李和脆红李在代谢水平上有较大的差异。且各样品及mix组内的Pearson相关系数均大于0.9，说明组内的重复样本相关性极强、重复性好，可以用于后续差异代谢物分析。

2.3 OPLS-DA结果

图3 3 个比较组OPLS-DA得分图和验证图Fig. 3 OPLS-DA score plot and permutation test plot

2.4 差异代谢物筛选与鉴定

基于OPLS-DA结果，以VIP≥1、FC≥2和FC≤0.5筛选出不同比较组的差异代谢物。通过火山图可以清晰看出代谢物在各比较组中数目及变化情况，如图4所示，FTL_vs_CHL筛选到的差异代谢物有70 种（上调43 种、下调27 种），FTL_vs_KXL和KXL_vs_CHL分别筛选到96 种（上调84 种、下调12 种）和75 种（上调19 种、下调56 种）。

图4 3 个比较组差异代谢物火山图Fig. 4 Volcano map of differential metabolites among three varieties

2.4.1 蜂糖李与脆红李差异代谢物分析

表2 FTL_vs_CHL果实中差异代谢物Table 2 Differential metabolites in Fengtang_vs_Cuihong

由表2得知，FTL_vs_CHL之间筛选到9 类70 种差异代谢物，包括26 种氨基酸及其衍生物（19种上调、7 种下调），16 种有机酸（7 种上调、9 种下调），8 种核苷酸及其衍生物（4 种上调、4 种下调），6 种糖类（2 种上调、4 种下调），4 种溶血磷脂酰胆碱上调，4 种维生素（1 种上调，3 种下调），3 种游离脂肪酸上调，2 种溶血磷脂酰乙醇胺上调，1 种甘油酯上调。结果表明：与蜂糖李相比，脆红李中上调的物质多于下调物质，有多种氨基酸及其衍生物上调表达且相对含量增加，其次是溶血磷脂酰胆碱和游离脂肪酸。其中缬氨酸可以根据其构象分为-缬氨酸和-缬氨酸，是人体必需氨基酸之一，通常以-缬氨酸的形式在人体中存在。有研究表明-缬氨酸参与多种生理反应，影响炎症和肿瘤的发生与转归。维生素中仅有吡哆醛上调表达，为VB的组成成分，而吡哆醛激酶是VB代谢的关键酶。相较于蜂糖李，脆红李有多种有机酸和糖类物质表达下调且相对含量降低，可能是脆红李果实口味酸甜适中的原因之一。

2.4.2 蜂糖李与空心李差异代谢物分析

表3 FTL_vs_KXL果实中差异代谢物Table 3 Differential metabolites in Fengtang_vs_Kongxin

如表3所示，FTL_vs_KXL筛选出差异代谢物共10 类96 种，包括21 种有机酸、18 种核苷酸及其衍生物、17 种氨基酸及其衍生物、13 种溶血磷脂酰胆碱、9 溶血磷脂酰乙醇胺、5 种维生素、5 种糖类、4 种醇类、3 种游离脂肪酸、1 种甘油酯。其中上调物质有84 种，占87.50%；下调物质12 种，占12.50%。说明与蜂糖李相比，空心李中绝大多数代谢物质相对含量增加，少数降低。糖酸含量及其配比是果实风味形成的关键，其中糖含量在很大程度上决定了果实的甜度，有机酸含量决定了果实酸度。有机酸在空心李果实中上调且相对含量增加，相反在蜂糖李中下调且相对含量降低，表明了蜂糖李的酸度要低于空心李。这与李刚凤等的研究空心李酸（2.06%～3.90%），董晓庆等的研究蜂糖李的酸（0.15%～0.32%）结论相致。蜂糖李果实有机酸含量低但含有较高的糖类（如-果糖、-葡萄糖、甘露糖、-蔗糖*、葡萄糖酸葡萄糖-1-磷酸*等），具有低酸高糖的特点，所以造就成其独特的风味因而具有较高的商品价值。空心李果实中氨基酸及其衍生物上调12 种，其含量高于蜂糖李，这与李刚凤等研究结果相一致。

2.4.3 空心李与脆红李差异代谢物分析

表4 KXL_vs_CHL果实中差异代谢物Table 4 Differential metabolites in Kongxin_vs_Cuihong

由表4可知，在KXL_vs_CHL比较组筛选到差异代谢物10 类75 种，包括核苷酸及其衍生物19 种、氨基酸及其衍生物17 种、有机酸14 种、血磷脂酰胆碱7 种、维生素7 种、糖类4 种、醇类4 种、溶血磷脂酰乙醇胺1 种、游离脂肪酸1 种、甘油酯1 种。结果显示上调表达19 种，下调表达56 种，其中差异较大的是核苷酸及其衍生物、氨基酸及其衍生物、有机酸3 种类别，分别占比25.33%、22.67%和18.67%。与空心李相比，核苷酸及其衍生物，氨基酸及其衍生物，有机酸等这类物质在脆红李中下调表达，在空心李中上调表达。在KXL_vs_CHL的19 种核苷酸及其衍生物中，只有2 种上调，其他均下调。其中腺苷、鸟苷、腺苷-5’-单磷酸等相对含量较高。氨基酸及其衍生物下调10 种，上调7 种。氨基酸类物质的种类和含量是判断果实营养价值的主要指标之一，与果实的营养及风味形成密切相关。张绍阳等对空心李果实营养进行分析，检测出的15 种氨基酸中天冬氨酸含量最高，其次为丙氨酸、谷氨酸与赖氨酸，组氨酸最少，本研究结果与此一致。其中谷氨酸与天冬氨酸是鲜味氨基，甘氨酸、丙氨酸等为甜味氨基。此外谷氨酸还是脑组织生长代谢中的重要物质，参与多种生理活性物质的合成，在大脑、肌肉、肝脏等组织中发挥重要的解毒作用，还可保护肝脏。

2.5 差异代谢物通路分析

基于KEGG数据库对差异代谢物进行代谢通路富集分析，通过对差异代谢物进行通路富集分析有助于理解差异代谢物在代谢途径的变化机制。如图5A所示，FTL_vs_CHL的70 种差异代谢物共注释到57 条代谢通路，主要分布在20 条代谢途径中，前5 条富集代谢物数量多且显著差异的代谢通路（＜0.05）分别为代谢通路、氨酰-tRNA生物合成通路、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成通路、硫代葡萄糖苷的生物合成通路和赖氨酸降解通路，富集到的差异代谢物主要为氨基酸及其衍生物、有机酸、核苷酸及其衍生物。其中有6 种氨基酸及其衍生物、2 种有机酸参与了多个代谢途径。在显著差异的5 条代谢通路中硫代葡萄糖苷的生物合成途径最为显著（值最小），参与硫代葡萄糖苷的生物合成通路有6 个差异代谢物，分别是-缬氨酸、-异亮氨酸*、-亮氨酸*、-甲硫氨酸、-酪氨酸、-色氨酸。其中-色氨酸是营养中重要的氨基酸，人体内自身不能合成需要从外界摄取，-酪氨酸是多种重要的次级代谢物的通用前体，可以用作帕金森氏病药物左旋多巴的合成。

FTL_vs_KXL的96 种差异代谢物共注释到53 条代谢通路，如图5B所示，前5 条代谢通路富集差异代谢物数多且较显著的为代谢通路、嘌呤代谢通路、精氨酸和脯氨酸代谢通路、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢通路和色氨酸代谢通路，富集到的差异代谢物主要包括核苷酸及其衍生物、有机酸、氨基酸及其衍生物和维生素。其中有12 种核苷酸及其衍生物、6 种有机酸和4 种氨基酸及其衍生物参与多个代谢途径。显著差异通路有1 条为色氨酸代谢通路（＜0.05）。参与色氨酸代谢通路的有3 个差异代谢物，分别是-色氨酸、5-羟基--色氨酸、2-吡啶甲酸。其中2-吡啶甲酸是一种重要的吡啶类化合物，广泛用于农药、医药、以及日用化学品的生产。

KXL_vs_CHL的75 种差异代谢物注释到52 条代谢通路，如图5C所示，前5 条代谢通路富集差异代谢物数量多且显著的为代谢通路、ABC转运蛋白、2-氧羧酸代谢通路、嘌呤代谢通路、硫代葡萄糖苷的生物合成通路，富集到的差异代谢物主要包括核苷酸及其衍生物、有机酸、维生素、氨基酸及其衍生物。其中有10 种核苷酸及其衍生物、1 种有机酸，1 种维生素及5 种氨基酸及其衍生物参与了多个代谢途径。显著差异通路2 条（＜0.05）：嘌呤代谢通路和硫代葡萄糖苷的生物合成通路，其中嘌呤代谢通路最为显著（值最小），参与嘌呤代谢通路有10 个差异代谢物，分别是次黄嘌呤、鸟嘌呤、2’-脱氧腺苷、腺苷、2’-脱氧鸟苷、鸟苷、环-3’,5’-腺嘌呤核苷酸、腺苷-5’-单磷酸、5’-肌苷酸、鸟苷-5’-单磷酸，都为核苷酸及其衍生物，其中嘌呤是一种生物碱，主要以嘌呤核苷酸的形式存在，可分为鸟嘌呤、腺嘌呤、次黄嘌呤等，广泛参与人体的各种生命活动。

以上分析表明，3 组比较组之间有多条代谢通路一致，部分代谢物参与多个代谢途径。

图5 3 个比较组差异代谢物KEGG富集图Fig. 5 KEGG enrichment map of different metabolites among three varieties

3 结 论

3 个李品种果实共检测出12 类307 种初生代谢物，FTL_vs_CHL和FTL_vs_KXL的差异代谢物分别为70 种和96 种，且主要以上调为主；KXL_vs_CHL的差异代谢物有75 种，以下调为主。值小于0.05的显著差异代谢途径FTL_vs_CHL有5 条，分别为代谢通路、氨基酰-tRNA生物合成通路、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成通路、硫代葡萄糖苷的生物合成通路和赖氨酸降解通路，FTL_vs_KXL仅有1 条色氨酸代谢通路，KXL_vs_CHL有2 条分别是嘌呤代谢通路和硫代葡萄糖苷的生物合成通路。

本研究成功鉴定出空心李（环-3’,5’-腺嘌呤核苷酸）和脆红李（溶血磷脂酰胆碱16:2）的特征成分。利用UPLC-MS/MS技术对蜂糖李、空心李和脆红李的初生代谢物进行分析，所检测到的物质可为李果实的功能研究及下一步开发利用提供参考，也为李果实优良品种选育和功能保健食品的开发提供理论依据，具有广阔的开发利用前景。