环境因素对β-胡萝卜素复合纳米粒子稳定性的影响

郭 静，孙晓琳，潘思轶

（华中农业大学食品科学技术学院，湖北 武汉 430070）

-胡萝卜素是一类重要的类胡萝卜素，是一种亲脂性天然色素，广泛存在于自然界并具有抗氧化、抗癌、提高免疫力等生理功能。但-胡萝卜素的稳定性较差，在加工贮藏时极易受到光照、高温、pH值等因素影响导致其发生化学降解，同时，由于-胡萝卜素具有高度亲脂性，在水溶液中溶解度较低，这都限制了其在食品、医药工业中的应用。

克服这些限制的有效方法之一是通过递送载体包封-胡萝卜素。近年来，生物聚合物纳米颗粒因其良好的生物相容性、低免疫原性、无毒性和生物可降解性的优点，受到了人们的关注。天然存在的蛋白质和多糖是包封亲脂性活性物质的重要材料。蛋白质-多糖复合物可以提高亲脂性活性物质的稳定性和溶解性。但蛋白质-多糖复合物在递送活性物质时仍存在一定的局限性，例如稳定性较差、生物利用率较低等问题。之前的研究表明，食品级表面活性剂如吐温80、鼠李糖脂、茶皂素等，可以通过静电作用、疏水相互作用与生物聚合物结合形成保护涂层，从而提高亲脂性活性物质的化学稳定性，延缓其在体外消化过程中的释放。Guo Qing等的研究结果表明，加入表面活性剂后，豌豆分离蛋白-高甲氧基果胶-表面活性剂（鼠李糖脂、茶皂素和月桂酰精氨酸乙酯）可以包封白藜芦醇，在体外消化过程中可以延缓白藜芦醇的光降解和热降解，且三元复合物中白藜芦醇的释放率低于二元复合物。

玉米醇溶蛋白独特的氨基酸组成使其成为两亲性蛋白质，并具有良好的成膜性和阻隔性，因此在活性物质和风味物质的包埋递送中应用广泛。海藻酸丙二醇酯（propylene glycol alginate，PGA）是海藻酸和环氧丙烷通过酯化反应生成的海藻酸衍生物，是一种可以与蛋白质结合的、具有表面活性的食品级多糖。卵磷脂是一种天然小分子表面活性剂，由脂肪酸和磷酸酯基酯化的甘油骨架组成，具有两亲性，因此具有良好的乳化性能，可以用作食品乳化剂。

因此，本研究采用反溶剂沉淀法制备玉米醇溶蛋白-卵磷脂-PGA三元复合物实现对-胡萝卜素的包埋，并重点考察环境因素（温度、pH值、光照）对-胡萝卜素纳米粒子分散体系稳定性的影响，以期为-胡萝卜素的进一步加工及长期贮存提供帮助。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

-胡萝卜素（生物试剂，97%）、玉米醇溶蛋白、大豆卵磷脂（≥90%） 上海源叶生物科技有限公司；PGA 河南万邦化工科技有限公司；无水乙醇、正己烷、氢氧化钠、盐酸（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

Malvern Nano ZS纳米粒度电位分析仪 英国马尔文公司；UV-1800紫外分光光度计 日本岛津公司；UltraScan VIS色差仪 美国HunterLab公司。

1.3 方法

1.3.1-胡萝卜素纳米颗粒的制备

根据Wei Yang和Dai Lei等的方法制备-胡萝卜素复合纳米颗粒，并进行修改。称取25 mg玉米醇溶蛋白、50 mg卵磷脂和12.5 mg PGA置于烧杯中，加入20 mL 90%乙醇溶液，在室温下密封避光磁力搅拌2 h至完全溶解，再称取一定量的-胡萝卜素置于烧杯中，分别达到1∶1、1∶3、1∶5、1∶10和1∶25的质量比（-胡萝卜素比玉米醇溶蛋白），加入20 mL 90%乙醇溶液，在室温下密封避光磁力搅拌2 h至完全溶解。使用注射器将40 mL上述混合物缓慢注入60 mL蒸馏水中，将所得体系在室温下连续搅拌30 min。制得的溶液在35 ℃下旋转蒸发除去体系中的乙醇。制得的溶液在2 000 r/min离心10 min以去除不溶性杂质。将部分最终分散液贮存在4 ℃下进行进一步分析，并将另一部分冷冻干燥以获得粉末。为进行比较，使用与上述相同的方法制备玉米醇溶蛋白/-胡萝卜素纳米颗粒、玉米醇溶蛋白-卵磷脂/-胡萝卜素和玉米醇溶蛋白-卵磷脂-PGA/-胡萝卜素纳米颗粒。

1.3.2 纳米颗粒粒径及电位的测定

取一定量样品用去离子水稀释10 倍后用纳米粒度电位分析仪测定样品的粒径及电位。测定条件：材料折射率1.590，分散介质水折射率1.330，温度25 ℃。实验平行测定3 次。

1.3.3 包封率的测定

标准曲线的绘制：配制不同质量浓度梯度的-胡萝卜素标准液，使用紫外分光光度计在波长456 nm处测定吸光度，制定-胡萝卜素标准曲线。采用吸光度-质量浓度绘制线性关系图，得出校正曲线=0.217 9－0.047，相关系数大于0.99。

包封率的测定：参考吴晓琳等的方法并加以修改。取1 mL样品和3 mL正己烷涡旋60 s，在5 000 r/min离心10 min，取上清液于10 mL棕色容量瓶中，重复3 次合并上清液后定容，使用紫外分光光度计在波长456 nm处测定吸光度。包封率按式（1）计算：

式中：为-胡萝卜素总质量/mg；为游离的-胡萝卜素质量/mg。

1.3.4 透射电镜观察

利用透射电镜观察-胡萝卜素纳米粒的显微形态，吸取少量样品滴加至铜网上，于通风处自然干燥，滴加少量磷钨酸负染，自然干燥后置于透射电镜下观察微观形态并拍照，加速电压为100 kV。

1.3.5 分散体系冻干后的溶解性

称取2 mg冻干样品于烧杯中，加入20 mL去离子水，测定样品在波长456 nm处吸光度。之后每10 min测定一次样品在波长456 nm处吸光度，直至吸光度达到最大且不再上升。实验平行测定3 次。

1.3.6 分散体系冻干后的重分散性

称取5 mg的冻干样品于烧杯中，加入15 mL去离子水，在室温下磁力搅拌2 h至完全溶解，测定样品的粒径、电位及多分散指数（polydispersity index，PDI）。实验平行测定3 次。

1.3.7 色差的测定

取一定量样品装入石英比色皿中，用色差仪测定样品的亮度*、红值*、黄值*，色差仪使用前用白色校正板进行校正。实验平行测定3 次。通过计算总体色差（Δ*）作为评价体系颜色变化的指标，而色差中的黄值（*）可以定性表示-胡萝卜素的降解程度。总体色差按式（2）计算：

1.3.8 温度在贮藏过程中对体系稳定性的影响

将新制备的玉米醇溶蛋白/-胡萝卜素纳米颗粒、玉米醇溶蛋白-卵磷脂/-胡萝卜素纳米颗粒、玉米醇溶蛋白-卵磷脂-PGA/-胡萝卜素纳米颗粒分装与试剂瓶中，分别置于4、25、37 ℃下避光贮藏7 d，每天定时取样，测定样品的平均粒径、Zeta电位、色度和吸光度。实验平行测定3 次。

1.3.9 pH值对体系稳定性的影响

将新制备的玉米醇溶蛋白/-胡萝卜素纳米颗粒、玉米醇溶蛋白-卵磷脂/-胡萝卜素纳米颗粒、玉米醇溶蛋白-卵磷脂-PGA/-胡萝卜素纳米颗粒分装与试剂瓶中，用NaOH溶液和HCl溶液将体系pH值分别调节为3、4、5、6、7、8，室温下避光放置24 h，测定样品的平均粒径、Zeta电位、色度和吸光度。实验平行测定3 次。

1.3.10 光照对体系稳定性的影响

将新制备的玉米醇溶蛋白/-胡萝卜素纳米颗粒、玉米醇溶蛋白-卵磷脂/-胡萝卜素纳米颗粒、玉米醇溶蛋白-卵磷脂-PGA/-胡萝卜素纳米颗粒分装与试剂瓶中，用紫外灯在室温下照射4 h，每隔1 h取样，测定样品的平均粒径、Zeta电位、色度和吸光度。实验平行测定3 次。

1.4 数据统计分析

为保证实验结果准确，减小误差，所有实验均进行3 次平行并采用平均值，使用SPSS进行方差分析，＜0.05，差异显著，并使用Origin 8.5作图。

2 结果与分析

2.1 玉米醇溶蛋白对β-胡萝卜素包封性能

包封率是评价生物活性物质包埋效果的重要指标。如图1所示，当-胡萝卜素和玉米醇溶蛋白的比例为1∶1时，玉米醇溶蛋白无法负载过量的-胡萝卜素，此时大量-胡萝卜素游离在分散体系外。当-胡萝卜素与玉米醇溶蛋白的质量比从1∶1变为1∶3时，包封率从84.62%显著增加到93.64%（＜0.05）。结果表明，当-胡萝卜素与玉米醇溶蛋白的质量比为1∶3时，包封效果最好。包封率高是因为玉米醇溶蛋白可以包封疏水性-胡萝卜素，加入表面活性剂卵磷脂可以与游离-胡萝卜素形成复合物，从而改善其包封率。PGA也可以促进-胡萝卜素在复合物中的渗入。这与Sun Cuixia等的结果一致，PGA还可以改善玉米醇溶蛋白纳米颗粒中槲皮素的包封率。随着-胡萝卜素和玉米醇溶蛋白比例逐渐减小，包封率降到82.87%，这是因为少量的-胡萝卜素与过量的玉米醇溶蛋白中丰富的脯氨酸结合不完全。因此选择-胡萝卜素和玉米醇溶蛋白的比例为1∶3进行后续实验。

图1 β-胡萝卜素与玉米醇溶蛋白比例对纳米颗粒分散体系包封率的影响Fig. 1 Effect of the ratio of β-carotene to zein on the encapsulation efficiency of nanoparticle dispersion systems

2.2 β-胡萝卜素纳米颗粒分析结果

表1 载β-胡萝卜素纳米颗粒的基本指标Table 1 Properties of nanoparticles loaded with β-carotene

平均粒径是评价纳米颗粒包埋的一个重要指标，与纳米颗粒的分布、包埋物质的黏度、表面积和其他物理化学性质的变化有关。Zeta电位是评价纳米颗粒表面带电荷的常用指标，它可以决定悬浮液、大分子或材料表面的粒子稳定性，与胶体系统中的电势相对应。一般情况下，纳米颗粒电位的绝对值越大，其相同电荷之间的斥力越大，纳米颗粒越不容易发生聚集沉淀，纳米体系越稳定。如表1所示，与玉米醇溶蛋白纳米颗粒、玉米醇溶蛋白-卵磷脂二元复合纳米颗粒相比，三元复合物具有更高的-胡萝卜素包封率，包封率可达93.63%。玉米醇溶蛋白-卵磷脂/-胡萝卜素纳米颗粒粒径为134.1 nm，显著低于玉米醇溶蛋白/-胡萝卜素纳米颗粒的粒径（406.1 nm），这可能因为玉米醇溶蛋白和卵磷脂在一定水平下可以形成紧凑的结构，从而减小纳米颗粒的尺寸，这结果与Jiao Yan等的研究结果一样。玉米醇溶蛋白-卵磷脂-PGA/-胡萝卜素纳米颗粒粒径为113.5 nm低于玉米醇溶蛋白-卵磷脂/-胡萝卜素纳米颗粒的粒径，推测是因为PGA与玉米醇溶蛋白之间的静电吸引能促进三元复合物的形成。玉米醇溶蛋白-卵磷脂-PGA/-胡萝卜素纳米颗粒（－27.47 mV）和玉米醇溶蛋白-卵磷脂/-胡萝卜素纳米颗粒（－26.87 mV）带的负电荷显著多于玉米醇溶蛋白/-胡萝卜素纳米颗粒（－12.30 mV），表明前两者具有更好的稳定性。

2.3 透射电镜结果

如图2所示，玉米醇溶蛋白/-胡萝卜素纳米颗粒分布不均匀，有一些颗粒聚集；玉米醇溶蛋白-卵磷脂/-胡萝卜素纳米颗粒和玉米醇溶蛋白-卵磷脂-PGA/-胡萝卜素纳米颗粒粒径分布较匀称，在水中的分散性较好。另外，从透射电镜图中所观察到的纳米粒子粒径明显小于使用纳米粒度电位分析仪测得的样品粒径。这可能是因为粒径仪测定的是纳米粒子的水合粒径，透射电镜观察的是水分蒸发后样品的粒径。

图2 玉米醇溶蛋白/β-胡萝卜素（a）、玉米醇溶蛋白-卵磷脂/β-胡萝卜素（b）和玉米醇溶蛋白-卵磷脂-PGA/β-胡萝卜素（c）的透射电镜图Fig. 2 TEM images of zein/β-carotene (a), zein-lecithin/β-carotene (b)and zein-lecithin-PGA/β-carotene (c)

2.4 分散体系冻干后的溶解性

将纳米颗粒制成冻干粉末可以较好提升样品的贮藏期和稳定性，便于食品的长期贮藏和运输，因此冻干粉末的溶解性和重分散性也是评价包埋体系的一个重要指标。本实验通过测定吸光度考察冻干粉末的溶解性，冻干粉末的溶解量随时间的延长而增加，溶液浓度不断增大，吸光度也不断增大。由图3可知，纳米颗粒在30～50 min内溶解最快，60 min后溶解度基本不变，吸光度达到最大。玉米醇溶蛋白-卵磷脂-PGA/-胡萝卜素冻干粉末吸光度最大，溶解性最好，玉米醇溶蛋白/-胡萝卜素冻干粉末的溶解性最差，可能是由于玉米醇溶蛋白表面没有包覆层导致其疏水基团暴露，玉米醇溶蛋白的强疏水性导致其冻干后重分散性较差，这与Ma Mengjie等的研究结果一致。

图3 3 种纳米颗粒冻干后的复溶性Fig. 3 Solubility of freeze-dried samples of three kinds of nanoparticles

2.5 贮藏过程中温度对体系稳定性的影响

2.5.1 温度在贮藏过程中对纳米粒子粒径的影响

-胡萝卜素的热稳定性较差，在加工贮藏时容易受到环境稳定影响发生异构化生产同分异构体，因此考察纳米颗粒在不同温度下贮藏过程中粒径等指标的变化十分重要。如图4所示，在4 ℃下贮藏7 d的玉米醇溶蛋白-卵磷脂/-胡萝卜素和玉米醇溶蛋白-卵磷脂-PGA/-胡萝卜素纳米颗粒平均粒径变化较小，37 ℃下贮藏的纳米颗粒平均粒径变化较大，玉米醇溶蛋白/-胡萝卜素纳米颗粒的平均粒径从406.1 nm增加到677.9 nm，增加了271 nm，玉米醇溶蛋白-卵磷脂/-胡萝卜素纳米颗粒的平均粒径从134.1 nm增加到212.0 nm，玉米醇溶蛋白-卵磷脂-PGA/-胡萝卜素纳米颗粒的平均粒径从113.5 nm增加到186.3 nm，玉米醇溶蛋白/-胡萝卜素纳米颗粒的平均粒径比玉米醇溶蛋白-卵磷脂/-胡萝卜素和玉米醇溶蛋白-卵磷脂-PGA/-胡萝卜素纳米颗粒的平均粒径增大的多。这可能是由于玉米醇溶蛋白包埋-胡萝卜素时，玉米醇溶蛋白表面缺少稳定剂，疏水作用增强，导致纳米颗粒易于聚集沉淀。如图4可以看出，卵磷脂和PGA的存在使复合纳米颗粒的结构更加紧密，并在25 ℃和37 ℃条件下对-胡萝卜素提供了更好保护，这与Dai Lei和Wei Yang等的结果一致。

图4 温度在贮藏过程中对玉米醇溶蛋白/β-胡萝卜素（a）、玉米醇溶蛋白-卵磷脂/β-胡萝卜素（b）和玉米醇溶蛋白-卵磷脂-PGA/β-胡萝卜素（c）分散体系粒径的影响Fig. 4 Effects of temperature on particle size of zein/β-carotene nanoparticles (a), zein-lecithin/β-carotene nanoparticles (b) and zeinlecithin-PGA/β-carotene nanoparticles (c) dispersion systems during storage

2.5.2 贮藏过程中温度对体系颜色的影响

在贮藏过程中，产品应在一段时间内保持颜色稳定，因此颜色也是判断纳米颗粒体系稳定性的一个重要指标。在贮藏过程中，样品颜色逐渐褪去，颜色的降解在一定程度上可以反映-胡萝卜素的降解。在大多数情况下，随着贮藏时间的延长，样品的*值和Δ*值逐渐变大，*值和*值逐渐变小。由图5可知，在贮藏过程中3 种纳米颗粒的Δ*值均随时间延长不断增大，*值不断减小，变化速率随温度的升高而增大。且玉米醇溶蛋白-卵磷脂-PGA/-胡萝卜素的分散体系的*值减少最小，说明三元复合物使/-胡萝卜素降解的最少，体系更加稳定。

图5 温度在贮藏过程中对纳米颗粒分散体系总体的影响Fig. 5 Effects of different temperatures on color parameters of nanoparticle dispersion systems during storage

2.6 pH值对体系稳定性的影响

在食品加工领域中，pH值可以调节食品饮料的口感，因此pH值对体系的影响程度也是考察纳米颗粒体系稳定性的一个重要指标。本研究通过平均粒径和Zeta电位的变化评估体系稳定性。由图6a、b可知，玉米醇溶蛋白/-胡萝卜素在pH 5时粒径较大，电位绝对值低，这可能是因为该条件与玉米醇溶蛋白的等电点（pH 6.2）接近，此时体系的净电荷少，蛋白质易发生聚集沉淀导致平均粒径较大，这一结果与Ba Chujie等之前的研究结果一致。玉米醇溶蛋白-卵磷脂/-胡萝卜素纳米颗粒在pH 5和pH 6时粒径较大，电位绝对值较低，但是粒径仍维持在200 nm以下。玉米醇溶蛋白-卵磷脂/-胡萝卜素纳米颗粒和玉米醇溶蛋白-卵磷脂-PGA/-胡萝卜素纳米颗粒的粒径在pH 3～8之间变化不大，初步判断具有较好的pH值稳定性，但是2 种分散体系分别在pH 6时电位绝对值较低，因此在该pH值条件下长期贮藏时的稳定性还有待进一步考察。

由图6c可知，3 种包埋体系颜色的变化规律与平均粒径及Zeta电位的变化规律基本一致，玉米醇溶蛋白/-胡萝卜素在pH 5时黄值明显减小，这可能是因为等电点附近时体系的净电荷少，导致蛋白质沉淀和-胡萝卜素的降解。在pH 3～5时，由于体系处于酸性环境中，-胡萝卜素易发生异构化降解，导致*值降低，这与Qian Cheng等的研究结果一致。

图6 pH值对3 种分散体系平均粒径（a）、Zeta电位（b）和b*值（c）的影响Fig. 6 Effect of pH on average particle size (a), zeta potential (b) and b* value (c) of three nanoparticle dispersion systems

2.7 光照对体系稳定性的影响

-胡萝卜素的光稳定性较差，在加工贮藏过程中极易因为光照发生降解，因此体系的光稳定性是考察纳米颗粒稳定性的一个重要指标。如图7a、b所示，在经过4 h紫外照射后，3 种包埋体系的粒径均稍有增加，玉米醇溶蛋白/-胡萝卜素分散体系的PDI明显增大，而玉米醇溶蛋白-卵磷脂/-胡萝卜素和玉米醇溶蛋白-卵磷脂-PGA/-胡萝卜素分散体系的PDI略微增大。这可能是因为仅使用玉米醇溶蛋白对-胡萝卜素进行包埋时，由于玉米醇溶蛋白表面没有包覆层，难以形成空间位阻，在紫外照射后较易发生分子重组。同时，在没有卵磷脂和PGA作为稳定剂和活性剂时，玉米醇溶蛋白的疏水基团暴露，在疏水作用下纳米颗粒极易聚集沉淀，导致平均粒径和PDI较大。PGA的存在可以进一步保护-胡萝卜素免受紫外线照射而引起降解，玉米醇溶蛋白-卵磷脂-PGA/-胡萝卜素分散体系的粒径较小且紫外照射前后PDI均较小。

由图7c可知，随着紫外照射时间增加，3 种包埋体系的*值均逐渐减小，说明三者都受到了光照的影响，玉米醇溶蛋白-卵磷脂/-胡萝卜素分散体系的黄值减小最多，玉米醇溶蛋白/-胡萝卜素和玉米醇溶蛋白-卵磷脂-PGA/-胡萝卜素分散体系的黄值减小相差不大。这是因为玉米醇溶蛋白分子中的芳香基团和双键具有紫外吸收能力，可以一定程度上的保护-胡萝卜素。玉米醇溶蛋白-卵磷脂/-胡萝卜素分散体系保护效果较差的原因可能是因为卵磷脂在紫外照射下易发生酸败变质，对紫外线更加敏感，影响了分散体系的稳定性。

图7 紫外照射对3 种分散体系粒径（a）、PDI（b）及b*值（c）的影响Fig. 7 Effect of UV irradiation on particle size (a), PDI (b) and b*value (c) of three nanoparticle dispersion systems

3 结 论

制备玉米醇溶蛋白-卵磷脂-PGA纳米颗粒，并研究-胡萝卜素与玉米醇溶蛋白的质量比对其包封率的影响，得到玉米醇溶蛋白-卵磷脂-PGA纳米颗粒的最佳包封率为（93.63±0.14）%，平均粒径为（113.53±1.3） nm，Zeta电位为（－27.47±0.87） mV。还探究玉米醇溶蛋白/-胡萝卜素纳米颗粒、玉米醇溶蛋白-卵磷脂/-胡萝卜素和玉米醇溶蛋白-卵磷脂-PGA/-胡萝卜素纳米颗粒在温度、时间、pH值和紫外光照等贮藏环境下的稳定性，玉米醇溶蛋白-卵磷脂-PGA/-胡萝卜素纳米颗粒在37 ℃下贮藏7 d后及在紫外灯照射4 h后均具有较好的理化性质，平均粒径在波长250 nm以下，PDI小于0.2，冻干后的纳米颗粒具有良好的复溶性和重分散性。这些结果表明，玉米醇溶蛋白-卵磷脂-PGA复合纳米颗粒可以作为一种有效的递送系统改善-胡萝卜素的物理稳定性。