混合耐冷菌的筛选及生活污水的降解研究

景依葶，田晓娟，魏晓霞，徐佳志，张新国，王铭也，魏 丽，宏亚丽，盖 轲

(1.陇东学院 岐伯医学院，甘肃 庆阳 745000；2.陇东学院 化学与化工学院，甘肃 庆阳 745000； 3.庆阳能源化工集团沃德石油技术有限公司，甘肃 庆阳 745000)

生物法污水处理是去除污水中有机物质的技术，该技术已在国内外得到广泛应用。其依赖生物处理系统中具有有机物分解能力的微生物达到处理污水的目的[1-2]。污水生物法处理中常见的污染物降解微生物一般为常温菌。我国北方寒冷地区气温较低，导致污水生物处理池中的温度也较低，尤其在冬季，低温环境导致污水生物曝气池中的温度常低于常温菌的适宜生长温度范围，使微生物的数量和活性降低，导致污水中的有机物质不能被迅速降解，污水降解效率低下，出水水质难以达标[3-4]。针对这一问题，工程设计中一般采用降低污泥负荷、延长污水停留时间和生物曝气池保温等措施，来增加低温环境下微生物对有机物质的分解时间并提高分解温度，从而改善污水处理效率[5-6]。但这些方法导致污水处理投资成本和运行费用增加。因此，改善北方寒冷地区污水处理效果是亟待解决的难题。

众所周知，低温是导致北方寒冷地区污水降解效果低下的主要原因。当水温低于10℃时，常温菌的新陈代谢活性下降。研究表明，耐冷菌的最高生长温度高于20℃，最适生长温度大于15℃，在0℃～5℃仍可生长繁殖[7]。耐冷菌耐受低温这一生长特性为解决北方寒冷地区污水处理效果不理想，并降低投资运行成本提供可行方案。国外对耐冷菌的研究及应用起步较早，而国内对这项工作的研究还处于探索阶段[8]。本研究对生活污水中的污泥进行低温驯化，并从中筛选分离耐冷COD去除功能菌，对单菌进行鉴定，并研究其低温生长特性和低温人工生活污水去除特性，再对优势耐冷功能菌进行组合，研究混合菌对低温人工生活污水中COD的去除情况，从而为改善我国北方寒冷地区生活污水处理效率提供指导。

1 材料与方法

1.1 实验材料

菌种来源：从甘肃省庆阳市西峰区东区污水处理厂和甘肃省庆阳市西峰区南区污水处理厂采集污泥样本，并于10℃条件下对污泥进行低温驯化。

富集培养基：葡萄糖8.0g、蛋白胨1.5g、酵母膏1.5g、K2HPO40.4g、(NH4)2SO40.5g、MgSO4·7H2O0.05g、CaCl20.10g、FeCl30.01g、MgCl20.10g、NaCl3.0g、L-半胱氨酸0.5g，去离子水定容至1000ml。固体富集培养基，在上述培养基中加入15g琼脂粉。灭菌条件：115℃，15min。

人工生活污水：葡萄糖0.17g、可溶性淀粉0.16g、乙酸钠0.23g、NH4Cl0.26g、蛋白胨0.15g、牛肉膏0.04g、(NH4)2SO40.03g、KH2PO40.07g、Na2CO30.06g，去离子水定容至1000ml。固体人工生活污水，在上述培养基中加入15g琼脂粉。COD为650mg/L。灭菌条件：115℃，15min。

1.2 主要设备及仪器

全恒温生化培养箱，BJPX-SG170Ⅱ型，山东博科生物产业有限公司；生物安全柜，BSC-1304ⅡA2型，苏州安泰空气技术有限公司；PCR仪，Proflex3×32，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；紫外分光光度计，DR6000型，哈希上海有限公司；多参数水质测定仪，5B-3B型，北京连华科技有限公司；多参数消解仪，LH-25A，北京连华科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 耐冷菌的筛选及分离纯化

将10℃低温驯化污泥按5%(体积分数)比例加入带有玻璃珠的无菌生理盐水中，充分振荡混匀，取混匀液体10ml加入90ml无菌液体富集培养基中，10℃，150r·min-1条件下恒温振荡培养10d，取培养后的上清液10ml，加入90ml新的无菌液体富集培养基，相同条件下培养7d，如此共进行4轮富集。将第4轮富集培养液混匀，用无菌生理盐水梯度稀释成10-2至10-7浓度，取不同浓度的稀释液各0.1ml，分别均匀涂布于无菌固体富集培养基上。10℃，150r·min-1，恒温培养，直至出现菌落。

用无菌接种针挑取单菌落分别接种至无菌富集培养基，10℃，150r·min-1条件下恒温振荡培养，定时取菌液测定600nm处的吸光度值(OD600值)。当OD600值为1.0时，按1%(体积分数)比例接种至200ml无菌人工生活污水中，10℃，150r·min-1条件下恒温振荡培养7d。取上清液离心，测COD，选择COD去除效果较好的菌株。

用无菌生理盐水分别稀释筛选的优势耐冷功能菌，涂布于固体人工污水培养基上，10℃恒温培养直至长出菌落。挑取单菌落在相同固体培养基上划线分离纯化，直至分离出单一菌株。-80℃保存菌种。

1.3.2 耐冷菌的鉴定

分别以纯化后的优势耐冷菌菌体为模板，扩增菌株的16SrDNA，扩增引物序列为：1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)，27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)。0.75%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，送上海英骏生物技术有限公司测序。测序结果提交NCBI数据库进行同源检测。

1.3.3 耐冷菌的生长曲线测定

将筛选出的优势耐冷菌活化，无菌生理盐水调整至OD600值为1.0，按1%(体积分数)比例接种至200ml无菌液体富集培养基，10℃，150r·min-1条件下恒温振荡培养，每12h取菌液，以未接种液体培养基为空白，测定菌液OD600值。每个实验设置3个平行，结果取平均值。以OD600值为纵坐标，培养时间(h)为横坐标，绘制各优势菌株的生长曲线，并计算菌株的比生长速率和世代时间。

比生长速率计算公式：

其中，κ为比生长速率(h-1)；x1为t1时的OD600值；x2为t2时的OD600值；t1、t2为培养时间(h)。

世代时间计算公式：

其中，g为世代时间(h)；κ为比生长速率(h-1)。

1.3.4 耐冷菌的COD降解性能测定

将优势耐冷功能菌在无菌液体富集培养基中活化36h，8000r·min-1离心10min，弃去上清液，用无菌生理盐水洗涤菌体3至4次，再用无菌生理盐水调整OD600值为1.0。按1%(体积分数)比例接种至200ml无菌人工污水中，10℃，150r·min-1条件下恒温振荡培养。每24h取上清液，离心，测COD。每个实验设置3次重复，结果取平均值。

1.3.5 COD测定方法

COD的测定采用重铬酸钾法(HJ828-2017)，具体操作步骤详见《水质化学需氧量的测定重铬酸钾法》(HJ828-2017)[9]。

2 结果与讨论

2.1 优势耐冷菌的筛选与鉴定

经过多次富集和反复纯化，从驯化污泥中筛选分离得到5株COD去除效果较好的低温功能菌，分别命名为WE-1、WE-2、WS-1、WS-2、FH。对以上5种菌株的16SrDNA序列进行扩增、测序，将16SrDNA序列提交NCBI库比对，选取同源性较高的菌种，结果见表1。结果显示，从低温驯化污泥中筛选分离出的5株功能菌分属于3个不同的属，其中WE-1、WE-2和FH属于假单胞菌属(Pseudomonassp.)，WS-1属于节细菌属(Arthrobactersp.)，WS-2属于土生拉乌尔菌属(Raoultellasp.)。假单胞菌属的菌所占比例最高，为60%。有研究表明，在0℃～5℃能够繁殖的耐冷细菌主要有假单胞菌属[10]、喜冷杆菌属[11]，节杆菌属[12]，嗜冷杆菌属[13]，黄杆菌属[14]等。本研究表明土生拉乌尔菌属中也存在耐冷菌。薛天福[15]从低温驯化污泥中筛选出8株COD降解效果较好的菌株，10℃条件下，对模拟农村生活污水COD去除效率最高的是假单胞菌属，为88.6%。刘婧[16]从高原湿地沼泽土壤中驯化分离得到6株COD去除效果较好的耐冷菌，其中假单胞菌在6℃～9℃对畜禽废水COD的降解效率高于63%。

表1 5株优势耐冷菌的相似菌种及相似度

图1 优势耐冷功能菌生长曲线(10℃)

2.2 优势耐冷菌的低温生长曲线

经测定，5株优势耐冷菌在10℃的生长曲线见图1。图1显示，接种后的0h～24h，5株菌均处于生长延滞期；24h～48h，5株菌的生长均进入对数期，OD600值迅速增大，从0.1左右增至2.0以上；培养48h以后，5株菌均进入平台期，且生长稳定。与李政弢等[17]的研究结果相比，本研究筛选的5株耐冷菌在10℃时生长的延滞期和对数期较短，均为24h，而稳定期较长，最高OD600值在2.5以上，高于其研究结果，这有利于菌株适应新的环境，说明菌株在污水中能稳定生存，从而稳定发挥去除COD的效果。根据10℃下优势耐冷菌的生长曲线分别计算其比生长速率和世代时间，结果见表2。根据表2可知，5株耐冷菌的生长速率在0.124h-1～0.152h-1之间，世代时间在4.46h～5.47h之间，其中世代时间最低的是WE-1，为4.46h。这说明，筛得的5株耐冷菌在10℃下能够正常生长代谢，且代谢活性较高。有研究表明，相较于中温菌，耐冷菌的生长速率较慢、世代时间较长[18]。本研究中，当温度降低至10℃时，筛得的5株耐冷菌能保持0.124h-1～0.152h-1的较高生长速率和4.46h～5.47h的世代时间，该温度下，中温菌的生长代谢已经大大减缓，甚至生长停滞。这说明利用筛得的耐冷菌去除低温生活污水COD的可行性。

表2 优势耐冷菌比生长速率和世代时间(10℃)

图2 优势耐冷菌对人工生活污水COD的去除效果(10℃)

2.3 单株耐冷菌的COD去除性能

将筛选出的5株耐冷菌分别接入无菌人工污水中，10℃恒温振荡培养，每24h取上清液，检测人工生活污水中的COD，结果见图2。图中显示，从低温驯化污泥中筛选出的5株耐冷菌在接入无菌人工生活污水中后，人工生活污水的COD含量均呈现下降趋势，且COD去除效果较好。结果显示，在接种后1天内，COD的去除率不佳，最高去除率为2.99%，对应菌株为WE-1。这可能与5株菌在10℃下的生长特性有关，该温度下，接种后1天内，5株菌均处于生长延滞期，此时人工生活污水中功能细菌的菌量不足，且细菌新陈代谢缓慢，这可能是造成COD去除效果不佳的原因。接种后第2天到第7天，人工生活污水中的COD含量迅速下降，各菌株对COD的去除率均大幅提高。去除效果最好的是WE-1和FH，其第7天的COD值分别为195.47mg/L和182.59mg/L，对应的COD去除率分别为71.91%和69.93%。接种第7天至第10天，人工污水中的COD值任仍呈下降趋势，但其下降速率略有减缓。分析原因，可能是此时人工污水中的COD低于195.47mg/L，环境中的营养物质逐渐被消耗，细菌死亡速率大于繁殖速率，活菌总量下降，导致COD去除效率减缓。因此，利用该菌降解生活污水时，要注意监测生活污水的COD值并及时补充污水进水，以保证细菌对COD的降解活性。接种后第10天，WE-1、FH、WE-2和WS-2的COD去除率分别是85.70%、84.10%、82.68%和80.26%，处理后的COD分别为92.95mg/L、103.32mg/L、112.58mg/L和128.34mg/L，其中WE-1对人工生活污水的去除率最高，COD降至100mg/L以下。研究结果表明，假单胞菌属的WE-1、FH和WE-2及土生拉乌尔菌属的WS-2在10℃下均能达到较好的人工生活污水去除效果，去除率均达到80%以上。姜安玺等[19]分离得到可去除COD的耐冷菌，在10℃下对人工生活污水中COD的去除率为81.9%。高新新等[20]从活性污泥中分离的一株去除污水中有机物的假单胞菌，其在4℃下对人工生活污水的去除率为71.2%。而本研究分离得到的耐冷菌在10℃下的COD最高去除率为85.70%，这说明其具有较好的生活污水处理应用潜力。

图3 混合耐冷功能菌对人工生活污水 COD的去除效果(10℃)

2.4 混合耐冷菌的COD去除性能

根据分离到的5株优势耐冷菌对人工生活污水的处理效果，将其按不同体积比例混合，观察10℃条件下，混合耐冷菌对人工生活污水中COD的去除效果，结果见图3。从图3可以看出，在相同接种量和实验条件下，接种培养后第7天，除配比4外，其他配比的混合菌人工生活污水COD去除率均高于单株菌。其中配比1和配比3的COD去除率分别为90.11%和91.89%，处理后的COD分别为64.28mg/L和52.72mg/L。配比2和配比4的COD去除率分别为87.30%和80.09%，处理后的COD分别为82.57mg/L和129.43mg/L。配比3对人工污水COD的去除率最高。本研究表明，与单菌相比，在人工生活污水的处理时间和COD去除程度方面，合理配比的混合耐冷菌表现优于单菌。马文成等[21]从低温污水中分离出的耐冷菌，其混合菌在5℃下6天对生活污水的COD去除率达87%，高于单株菌的去除率。黄秋婷等[22]从低温驯化的活性污泥中分离出的8株耐冷菌的混合菌，在10℃下，7天对实际农村生活污水COD的去除率为94.1%，其效果优于相同条件下的单株菌，已达到我国农田灌溉水质标准。这可能是因为通过不同的配比，改变了微生物群落结构，利用不同微生物对底物的处理优势，形成了更有效的有机物质转化链，从而使污水中的COD得到了更有效的去除。

3 结论

(1)从低温驯化的活性污泥中共筛选分离得到5株优势耐冷功能菌，经过细菌16SrDNA基因测序，NCBI库比对分析，5株菌中，WE-1、WE-2和FH属于假单胞菌属(Pseudomonassp.)，WS-1属于节细菌属(Arthrobactersp.)，WS-2属于土生拉乌尔菌属(Raoultellasp.)。5株耐冷菌在10℃条件下对人工生活污水的COD均有较好的去除效果。

(2)在10℃条件下，5株菌在人工生活污水中的生长特性为延滞期较短、稳定期较长，能够正常生长代谢，且代谢活性较高。比生长速率为0.124h-1～0.152h-1，世代时间为4.46h～5.47h，对低温生活污水COD的去除具备可行性。

(3)分离得到的单菌株在10℃条件下对人工生活污水COD去除性能均较好。培养第10天，假单胞菌属的WE-1、FH、WE-2和土生拉乌尔菌属的WS-2对人工生活污水的去除率均在80%上，分别为85.70%、84.10%、82.68%和80.26%，处理后的COD分别为92.95mg/L、103.32mg/L、112.58mg/L和128.34mg/L。人工生活污水COD去除效果最好的是假单胞菌属的WE-1。

(4)将分离得到的5株耐冷菌按不同体积比混合制成混合菌种，10℃条件下，混合菌对人工生活污水中COD的处理时间和去除效果优于单菌。表现最佳的是配比3，培养7天后，其COD的去除率为91.89%，处理后的COD为52.72mg/L。