牛黄消炎片中土大黄苷的检查方法研究

刘静

中国食品药品检定研究院

肖妍

中国食品药品检定研究院

于健东*

中国食品药品检定研究院

戴忠

中国食品药品检定研究院

马双成*

中国食品药品检定研究院

牛黄消炎片处方由人工牛黄、珍珠母、蟾酥、青黛、天花粉、大黄和雄黄七味药材组成，具有清热解毒，消肿止痛的功效[1-2]。处方中大黄为常用中药，自《中国药典》1953年版首次收载后，后续历版《中国药典》中均有收载，其来源为蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatumL.、唐古特大黄Rheum tanguticumMaxim.ex Balf.或药用大黄Rheum officinaleBaill.的干燥根和根茎，秋末茎叶枯萎或次春发芽前采挖，除去细根，刮去外皮，切瓣或段，绳穿成串干燥或直接干燥。具有泻下攻积，清热泻火，凉血解毒，逐瘀通经，利湿退黄的功效。用于实热积滞便秘，血热吐衄，目赤咽肿，痈肿疔疮，肠痈腹痛，瘀血经闭，产后瘀阻，跌打损伤，湿热痢疾，黄疸尿赤，淋证，水肿；外治烧烫伤[3-4]。统计表明，《中国药典》2020年版一部收载的中成药处方中涉及大黄及其炮制品的品种有160 余种，由此可见，大黄药材应用广泛。作为用药历史悠久的常用中药材，近年来随着中药现代化进程的不断推进，大黄药材市场需求量不断增加，但由于药材资源相对有限，导致目前市场上的商品大黄中常混有同属异种植物的根冒充大黄药用的现象，以华北大黄、河套大黄等非正品大黄较为常见。研究表明，与正品大黄所含番泻苷类成份不同的是，这些掺伪混用的大黄所含特征性成份为二苯乙烯苷类化合物，又以土大黄苷为代表性成份[5-9]。随着药品监管力度的不断加大[10]，国家药品监督管理局已批复了大黄补充检验方法和检验项目（批准件编号：2010001），并陆续颁布了增加土大黄苷检查项的中成药药品补充检验方法，如三黄片、牛黄解毒片、炎可宁片等，有效控制了相关品种的大黄掺伪问题。在此基础上，《中国药典》自2015年版一部起，大黄检查项中土大黄苷的检查方法修订为更为灵敏准确的薄层色谱法（TLC）。此外，多个含大黄中成药品种分别研究建立了土大黄苷的检查方法，主要以薄层色谱法和高效液相色谱法（HPLC）为主[11-16]。

本文研究建立了牛黄消炎片中土大黄苷的系列检测方法，包括采用 TLC 法对牛黄消炎片中土大黄苷进行快速筛查，并进一步采用 HPLC 和HPLC-MS/MS 法进行验证，以充分保障检查结果的准确性。研究结果显示，来自14 家生产企业的60 批样品经 TLC 快速筛查有17 批样品中检出土大黄苷成份，并进一步经HPLC 和HPLC-MS/MS 法对保留时间、紫外吸收光谱以及质谱裂解行为等相关信息进行了确证，表明牛黄消炎片个别生产企业存在大黄掺伪混用的情况，该系列检测方法为药品监管提供了强有力的技术支持。

1 仪器与试药

CAMAG自动点样仪、CAMAG-Reprostar 3 薄层色谱数码成像系统（瑞士卡玛公司）；Waters2695 高效液相色谱系统（包括Waters 2695 液相色谱仪、Waters2996 DAD 紫外检测器、自动进样器及EMPOWER 2 工作站）（美国沃特世公司）；Agilent 1200-6320 Ion trap 液质联用仪（美国安捷伦公司）；KQ-300DA 型数控超声波清洗仪（昆山超声仪器有限公司）；Millipore 滤水机（美国密理博公司）；AE240 型电子天平（瑞士梅特勒托利多公司）。

土大黄苷对照品（ 批号110794-201105）、人工牛黄对照药材（批号121197-201204）、珍珠母对照药材（批号121500-200501）、蟾酥对照药材（批号121132-200803）、青黛对照药材（批号121170-201102）和天花粉对照药材（批号121361-201202）均来自中国食品药品检定研究院；雄黄购于北京同仁堂股份有限公司；牛黄消炎片样品来自14 家生产企业A～N，共60 批，样品情况详见表1；甲苯、甲酸乙酯、丙酮、甲酸和甲醇均为分析纯（北京化学试剂公司）；聚酰胺薄膜（浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂）；乙腈和甲醇为色谱纯（美国Thermo Fisher 公司）。

表1 牛黄消炎片样品基本信息

续表

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液

精密称取土大黄苷对照品适量，加甲醇制成每1ml 含0.1mg、0.08mg 的溶液，分别作为TLC、HPLC 检查用对照品溶液。

分别取人工牛黄、蟾酥、天花粉、雄黄、珍珠母和青黛对照药材适量，按处方制得缺大黄阴性对照样品，取适量，加甲醇5ml，超声（功率：300W，频率：40kHz）30min，0.45µm 微 孔滤膜滤过，得到阴性对照溶液。

2.1.2 供试品溶液

取牛黄消炎片10 片，除去包衣，研细，加甲醇5ml，超声（功率：300W，频率：40kHz）30min，0.45µm 微孔滤膜滤过，得到供试品溶液。

2.2 TLC 法检查

2.2.1 色谱条件

薄层板：聚酰胺薄膜；展开剂：甲苯-甲酸乙酯-丙酮-甲酸-甲醇（30: 5: 5: 0.1: 20）；检视：紫外 UV 366nm 下检视；点样量：5µl。

2.2.2 结果

取TLC 检查用对照品溶液、阴性对照溶液和供试品溶液各5μl，分别点样于聚酰胺薄膜上，参照薄层色谱法（《中国药典》2020年版四部通则0502）试验。按2.2.1 检视条件检视，结果60批测试样品中有17 批在与土大黄苷对照品Rf值一致的位置有相同颜色的荧光斑点检出。部分样品TLC 结果，如图1所示。

图1 牛黄消炎片样品、对照品与阴性对照TLC 色谱图（UV 366 nm）

2.3 HPLC 法验证

2.3.1 色谱条件

色谱柱：PrevailTMC18 （250mm×4.6mm,5µm）；流动相：甲醇-乙腈-水（30: 7: 63）；流速：1.0 ml/min；柱温：30℃；检测波长：320nm；进样量：10µl。理论塔板数按土大黄苷峰计算应不低于2500。

2.3.2 检测限

取HPLC 检查用对照品溶液，加甲醇逐级稀释后进行测定，取信噪比（S/N）为3 ∶1时的浓度为检出限，结果为0.008μg/ml。

2.3.3 结果

取TLC 检查阳性供试品溶液、对照品溶液和阴性对照溶液各10µl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液在与土大黄苷对照品保留时间一致的位置均有色谱峰检出，同时提取该色谱峰的光谱图，结果显示在280～400nm 波长范围的吸收光谱与土大黄苷对照品一致。代表性样品HPLC 色谱图如图2、图3所示。

图2 代表性样品、对照品与阴性对照HPLC 色谱图

图3 紫外吸收光谱图

2.4 HPLC-MS/MS 法确证

2.4.1 色谱条件

同HPLC 法 2.3.1 项下。

2.4.2 质谱检测参数

电喷雾（ESI）离子化源；电离模式：负离子模式，全扫描模式；离子扫描范围：m/z100～500；雾化气：25psi；干燥气：12L/min；干燥温度：320℃；分流比：1: 9。

2.4.3 结果

在上述色谱与质谱条件下，土大黄苷对照品的准分子离子峰m/z419 [M-H]-，保留时间为19.4min；对该分子离子峰m/z419 [M-H]-进行二级全扫描质谱分析，产生的主要碎片离子为m/z257 [M-H-162]-，为丢失 葡萄糖基产生的碎片离子。17 批阳性样品经HPLC-MS/MS 分析，结果与土大黄苷对照品保留时间一致的色谱峰均能检测到m/z419 [M-H]-，即土大黄苷的准分子离子峰，进一步对m/z419 [M-H]-进行二级全扫描质谱分析，则均产生与对照品一致的碎片离子峰，相应的二级质谱图如图4所示。

图4 土大黄苷的二级质谱图

2.5 样品测定结果

综合上述薄层色谱法、高效液相色谱法和液质联用验证实验结果，本次抽检的14 家生产企业60 批样品中，有17 批检出土大黄苷，涉及4 家生产企业，具体结果详见表2。

表2 牛黄消炎片中检出土大黄苷成份结果情况

续表

3 讨论

牛黄消炎片中土大黄苷检查结果反映了处方中涉及的大黄药味存在一定程度的掺伪混用问题。本研究充分结合掺伪大黄中代表性成份土大黄苷的二苯乙烯苷结构特征，选取对此类成份具有良好分离效果的聚酰胺薄膜作为薄层板，利用其荧光特性进行检视，能够较好地排除干扰。此外，鉴于牛黄消炎片处方药味多，所含化学成份复杂等特点，本研究进一步建立了HPLC 和HPLCMS/MS 验证方法，能够进一步对保留时间、紫外吸收光谱、二级质谱测定等多方面信息进行综合比对分析。上述系列检查方法适用于大量样品的快速筛查，能够保证检查结果的准确性，为药品质量监管提供强有力的技术支持，对保障人民群众用药安全与有效具有重要意义。