基于响应面法优化橄榄多酚提取工艺

吴晓青，孙燕丽，钟碧萍，王倩雯

（福建生物工程职业技术学院，福建 福州 350007）

橄榄（Canarium albumRaeusch.）为橄榄科橄榄属乔木植物的果实，呈青色、卵圆形，所以也称为青果，药食同源，橄榄富含蛋白质、脂肪、碳水化合物维生素C等［1］。研究表明橄榄中所含的最重要的功效成分为多酚类化合物，如没食子酸、并没食子酸、短叶苏木酚等，具有增强免疫、抗氧化、抗病毒、抗菌、消炎镇痛、解酒护肝、抑制血糖升高、增加骨密度和骨钙含量、抗乙肝病毒等作用［2-6］。目前，常用的植物中多酚的提取方法有热回流法、浸提法、超声提取法等，其中超声提取法是应用超声波强化提取植物的有效成分，当超声强度达到一定程度时，能够破坏植物细胞壁结构，使其瞬间破裂，细胞内的有效成分得以释放，直接进入溶剂从而提高提取率［7］；且超声提取法操作简单，提取效率高，可以采用不同溶剂以满足不同目标物提取的需要，尤其可以在低温下操作，非常适宜于热敏性物质的提取［8］。故本试验选用超声提取法提取橄榄多酚，通过单因素试验结合响应面法，优化橄榄多酚的最佳提取工艺，为推动橄榄多酚的大规模生产和功能产品的开发奠定基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器 UV-1800PC DS2型紫外可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；AL204电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；KQ-600GKDV型高功率恒温数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；SHA-B恒温振荡器（常州国华电器有限公司）；DS-1高速组织捣碎机（上海精科实业有限公司）。

1.2 试药 橄榄购自福建闽清，经福建中医药大学中药鉴定教研室范世明高级实验师鉴定为橄榄科植物橄榄（Canarium albumRaeusch.）的果实；没食子酸对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号：B20851，纯度≥98%）；碳酸钠、福林酚试剂、无水乙醇等试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 橄榄多酚提取液的制备 取橄榄鲜果，洗净，去核，60℃热风干燥至恒重，粉碎，过40目筛，即得橄榄粉。精密称取橄榄粉1 g，加入一定浓度的乙醇溶液，置于超声波处理装置中，调节功率为600 W，按照“2.3”和“2.4”项下的要求提取，过滤，滤液用适量蒸馏水稀释，备用。

2.2 橄榄多酚得率的测定 采用课题组前期优化的橄榄多酚福林酚比色法测定橄榄多酚得率［9］。精确称取没食子酸对照品适量，蒸馏水稀释制成25μg/mL没食子酸对照品溶液。分别精密量取没食子酸对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，稀释后的橄榄多酚提取液1.0 mL，置刻度离心管中，加福林酚试剂3.0 mL，10%Na2CO3溶液4.0 mL，加水稀释至25.0 mL，摇匀，在40℃恒温水浴中反应45 min后，在765 nm波长条件下测定吸光度。以吸光度值Y为纵坐标，没食子酸质量浓度X（μg/mL）为横坐标，绘制标准曲线，得出回归方程为Y＝1.32×10-1X＋7.21×10-3，r＝0.999 8，没食子酸在1.008 0～5.040 0μg/mL范围内具有良好的线性关系。根据标准曲线计算以没食子酸为当量的橄榄多酚质量浓度，并按下列公式计算橄榄多酚得率：

式中：C为回归方程计算出的质量浓度（单位：μg/mL）；m为样品质量（单位：g）；V为测定时反应体系总体积（单位：mL）；N为稀释倍数。

2.3 单因素试验及结果分析

2.3.1 乙醇浓度对橄榄多酚得率的影响 甲醇、乙醇、丙酮、水均为植物多酚的常用提取溶剂，当样品为固体时，纯的有机溶剂不足以破坏样品中多酚类物质与蛋白质或其他物质的连接，多酚的提取率低，但当提取剂中水的比例过高时，糖等水溶性杂质的浸出率也较高。不同极性溶剂对多酚物质的提取效果有显著的影响，故本试验选用安全性更高的乙醇作为有机溶剂，与水混合成适当极性的溶液作为橄榄多酚提取的溶剂。在液料比为30 mL/g、超声时间为30 min、超声温度为40℃的条件下，分别考察乙醇浓度为30%、40%、50%、60%、70%时的橄榄多酚得率，结果见图1。图1显示：橄榄多酚得率随着乙醇浓度的上升，呈现先上升后下降趋势，当乙醇浓度为50%时，橄榄多酚得率达到最大值。故50%乙醇溶液提取橄榄多酚较佳。

图1 乙醇浓度对橄榄多酚得率的影响

2.3.2 液料比对橄榄多酚得率的影响 原料和溶剂接触面积与液料比有关，影响橄榄多酚的提取效果。以50%乙醇溶液为提取溶剂，在超声时间为30 min、超声温度为40℃的条件下，分别考察液料比为10、20、30、40、50 mL/g时的橄榄多酚得率。结果见图2。图2显示：随着液料比提高，橄榄多酚得率呈现先上升后下降的趋势，当液料比达到30 mL/g时，橄榄多酚得率达最大值。故液料比为30 mL/g时提取橄榄多酚较佳。

图2 液料比对橄榄多酚得率的影响

2.3.3 超声时间对橄榄多酚得率的影响 在一定时间范围内，延长提取时间可以增加多酚的溶出量，但当提取时间继续延长时，多酚已基本溶出或溶剂对物料的作用达到某种平衡，并且时间过长会破坏多酚的化学结构，影响多酚的提取效果。以50%乙醇溶液为提取溶剂，在液料比为30 mL/g、超声温度为40℃的条件下，分别考察超声时间为10、20、30、40、50 min时的橄榄多酚得率，结果见图3。图3显示：随着提取时间的延长，橄榄多酚的提取率先上升后下降，当超声时间为30 min时，橄榄多酚得率达到最大值。随着提取时间的继续延长，橄榄多酚的得率反而下降。故超声时间为30 min时提取橄榄多酚较佳。

图3 超声时间对橄榄多酚得率的影响

2.3.4 超声温度对橄榄多酚得率的影响 由于温度升高，细胞壁渗透性增强，胞内物质更易溶出，但超声温度过高时，多酚类物质结构被破坏、降解。以50%乙醇溶液为提取溶剂，在液料比为30 mL/g、超声时间为30 min的条件下，分别考察超声温度为30、40、50、60、70℃时的橄榄多酚得率，结果见图4。图4显示：随着超声温度的不断上升，橄榄多酚提取率先上升后下降。故超声提取温度50℃较适宜。

图4 超声温度对橄榄多酚得率的影响

2.4 响应面法试验及结果分析

2.4.1 响应面法试验 为进一步研究变量之间交互作用的影响关系，使用响应面法优化橄榄多酚提取的最佳工艺。根据Box-Behnken中心组合设计原理，在单因素试验基础上，以多酚得率（Y）为响应值，以影响提取的主要因素乙醇浓度（A）、液料比（B）、超声时间（C）、超声温度（D）为影响因素，设计四因素三水平响应面法试验。响应面因素与水平设计见表1。

表1 响应面因素与水平设计

2.4.2 统计分析和模型拟合 采用Design-Expert 10.0.1软件设计试验样本共计29个，其中中心组5个，响应面法试验设计及结果见表2。通过数据分析得到回归拟合方程为：Y＝6.956＋0.297 5A＋0.170 833B-0.002 5C－0.042 5D－0.032 5AB－0.042 5AC＋0.052 5AD－0.082 5BC＋0.032 5BD＋0.022 5CD－0.4234 17A2－0.358 417B2－0.480 917C2－0.465 917D2。

表2 响应面法试验设计及结果

对橄榄多酚得率预测数学模型进行方差统计分析，F值越大，表明有关模型分量对响应影响贡献度越高；当显著性检验概率P＜0.05时，表明该变量对响应值影响显著，当P＜0.01时，表明该变量对响应值影响非常显著。由表3可知，按影响橄榄多酚得率贡献大小排序为：A＞B＞D＞C，即乙醇浓度＞液料比＞超声温度＞超声时间。模型的决定系数（R2）为0.977 3，说明模型拟合优度较高，且调整后的决定系数（R2adj）＝0.954 5，能够解释实验95.45%的响应值变化，并与预测相关系数（R2pred）相差不大，表明该模型具备较高预测精准度。综上，上述模型可用于分析和预测橄榄多酚的最优得率。

表3 响应面试验方差分析

2.4.3 响应面分析 两两因素交互作用对橄榄多酚提取得率的影响见图5～图10。从图5可见，乙醇浓度和液料比的交互作用对橄榄多酚得率的影响呈抛物面分布，当乙醇浓度一定时，随着液料比的增加，橄榄多酚得率先上升后小幅下降；当液料比不变时，随着乙醇浓度的提高，橄榄多酚得率也呈现先增加后小幅减小。仅考虑二者因素作用下的最优组合为乙醇浓度50%～60%，液料比30～35 mL/g。图6所示，乙醇浓度方向曲面波动幅度较大，表明该因素对橄榄多酚得率的影响较超声时间影响显著。橄榄多酚得率随随乙醇浓度和超声时间的增加均呈现先增加后下小幅下降变化。故取乙醇浓度为50%～60%、超声时间为25～35 min水平区间时橄榄多酚的得率最高。由图7可见，橄榄多酚得率随乙醇浓度和超声温度的增加呈先增后减变化，且在乙醇浓度方向的影响较大，乙醇浓度是橄榄多酚得率的敏感影响因子。当乙醇浓度为50%～60%，超声温度为45～55℃时，橄榄多酚得率较高。由图8可知，液料比和超声时间的交互作用等高线呈现显著椭圆形，表明二者交互作用对橄榄多酚得率影响显著。橄榄多酚得率随液料比和超声时间的增加呈先增后减变化。当液料比为30～35 mL/g，超声时间为25～35 min水平区间时，橄榄多酚得率较高。由图9可见，橄榄多酚得率随液料比和超声温度的增加呈先增后减变化。液料比为30～35 mL/g，超声温度为45～55℃水平区间时，可显著提高橄榄多酚得率。由图10可知，橄榄多酚得率随超声时间、超声温度添加量的增加呈先小幅增后减小变化。当超声时间为25～35 min，超声温度为45～55℃水平区间时，可提高橄榄多酚得率。

图5 乙醇浓度-液料比的交互作用对橄榄多酚得率影响的响应面及等高线图

图6 乙醇浓度-超声时间的交互作用对橄榄多酚得率影响的响应面及等高线图

图7 乙醇浓度-超声温度的交互作用对橄榄多酚得率影响的响应面及等高线图

图8 液料比-超声时间的交互作用对橄榄多酚得率影响的响应面及等高线图

图9 液料比-超声温度的交互作用对橄榄多酚得率影响的响应面及等高线图

图10 超声时间-超声温度的交互作用对橄榄多酚得率影响的响应面及等高线图

2.4.4 最优工艺条件的确定 为进一步准确确定最佳提取工艺，以橄榄多酚得率最大为优化目标，根据Design-Expert 10.0.1软件运行结果，在乙醇浓度、液料比、超声时间和超声温度的共同影响下，橄榄多酚的最优提取工艺为：乙醇浓度为53.43%，液料比为32.267mL/g，超声时间为29.621 min，超声温度为49.804℃，制备提取液。在此条件下模型预测的多酚得率为7.03%。

根据软件预测结果，结合实际工艺设置的可行性，确定橄榄多酚最佳提取工艺为：乙醇浓度为53%，液料比为32 mL/g，超声时间为30min，超声温度为50℃，在此条件进行3次平行验证试验，得橄榄多酚平均得率为7.01%，与模型预测结果接近，无统计学意义（P＞0.05），说明基于该响应面模型设计优化橄榄多酚提取的方法有效可行。

2.5 提取工艺验证 分别取橄榄粉10 g，按“2.4.4”项下橄榄多酚最佳提取工艺，提取制备3批提取液，分别测定橄榄多酚得率，实验结果提示经优化的橄榄多酚最佳提取工艺稳定可行。结果见表4。

表4 橄榄多酚提取工艺验证试验结果（n＝3）

3 讨 论

相对于正交实验的孤立试验点分析，通过响应面法试验，可以得到一个曲面型的分析模型，即连续的预测模型，因此在响应面法的优化过程中，能够对各个水平进行连续分析。相对于平均设计来说，响应面法的实验组合，能够通过更少的试验次数、更短的试验周期，获得更为准确的实验结果。故本试验在预实验基础上，选择采用响应面法优化超声提取法提取橄榄多酚的工艺。

实验通过单因素试验结合响应面法试验，考察乙醇浓度、液料比、超声时间、超声温度等工艺条件对橄榄多酚提取得率的影响。通过单因素试验发现各主要影响因素在一定范围内均呈现先增加后减少的趋势，故再运用响应面优化设计实验，获得了超声提取法提取橄榄中橄榄多酚的最佳提取工艺为：乙醇浓度53%，液料比32mL/g，超声提取时间为30min，超声温度为50℃。在此条件下橄榄多酚的得率为7.01%，与预测值7.03%基本一致。本研究结果可为橄榄多酚扩大规模的提取制备及功能产品的开发应用奠定基础。