超高效液相色谱-串联质谱法检测绿茶中16种农药残留

李自强，杨梅，张新忠，罗逢健，周利，楼正云，孙荷芝，王新茹，陈宗懋

超高效液相色谱-串联质谱法检测绿茶中16种农药残留

李自强1,2，杨梅1*，张新忠1*，罗逢健1，周利1，楼正云1，孙荷芝1，王新茹1，陈宗懋1

1. 中国农业科学院茶叶研究所农产品质量安全研究中心，浙江 杭州 310008；2. 吉林农业大学植物保护学院，吉林 长春 130000

建立了超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）同时检测绿茶中16种农药残留的分析方法。采用1%甲酸乙腈提取绿茶样品中的目标农药，经TPT-SPE柱净化，在电喷雾正离子源（ESI+）模式下电离，质谱多反应监测模式（MRM）对目标母离子和子离子进行扫描测定。通过对样品提取、净化以及色谱条件优化，目标农药浓度范围在0.005～1.000 mg·kg-1线性良好，相关系数R＞0.992 6；在0.010、0.050、0.100 mg·kg-1和1.000 mg·kg-14个添加水平下，平均回收率在74.0%～105.4%，相对标准偏差（RSD）＜20.0%；方法的定量限为10～50 μg·kg-1。该方法分析速度快，灵敏度高，各项技术指标均符合国内外相关法规标准，可满足绿茶中多种农药残留同时检测的要求。

农药多残留分析；超高效液相色谱-串联质谱；TPT-SPE柱净化；绿茶

茶树是我国主要经济作物之一，其生长环境一般为湿热环境，容易受到病虫草的侵害[1-3]。与其他饮品相比，茶具有抗炎、抗癌活性以及降低高血压、糖尿病和心脑血管疾病发生等功效，目前饮茶已经在全球范围内流行[4-5]。为了保证茶叶的产量和品质，施用农药依旧是目前茶园病虫害防治的主要措施，这可能造成茶叶农药残留问题[6]，因此农药残留带来的产品质量问题越来越受到人们关注。

目前，许多国家和国际组织均规定了茶叶中农药的最高残留限量（MRL）标准[7-8]。我国是茶叶出口大国，农药残留问题往往是我国茶叶出口的一道壁垒。欧盟作为我国茶叶出口的主要市场之一，部分农药的残留限量标准比我国更为严格，如氟虫脲、甲萘威、醚菊酯、噻虫胺等农药MRLs值均低于我国[9-10]。2016—2020年我国茶叶由于农药残留超标已被欧盟委员会食品与饲料快速预警系统（Rapid Alert System for Food and Feed，RASFF）通报多次，其中呋虫胺、啶氧菌酯、唑虫酰胺等农药均出现了超标情况[11]。我国在GB/T 2763—2021中新增了啶氧菌酯、杀扑磷及甲基异柳磷等农药在茶叶中的MRL值，并将茶叶中克百威的MRL值由0.05 mg·kg-1降至0.02 mg·kg-1。基于此，为保证我国茶叶出口，对上述农药的精确检测十分必要。

由于农药种类众多，其自身结构及化学性质均有不同，需要用不同类型的仪器设备进行检测[12]。目前，茶叶中农药残留检测的分析仪器包括液相色谱（LC）[13]、气相色谱（GC）[14]、高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）[15]、超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）[16]、气相色谱-串联质谱（GC-MS/MS）[17]等。与其他几种检测技术相比，UPLC-MS/MS因其具有灵敏度高、可有效降低基质及其他因素的干扰等特点，目前已经成为茶叶中多种类型农药残留分析的首选方法[18]。此外，由于茶叶基质的复杂性，样品前处理是影响测量结果能否精确的关键性步骤。目前，茶叶的前处理方法主要有分散固相萃取（DSPE）[19]、QuEChERS（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe）方法[20]、分散液-液微萃取法（DLLME）[21]及固相萃取（SPE）[22]等。SPE因其具有操作简便，易与检测仪器联用，适配性好和回收率好等优点[23]，成为实验室中最常用的样品前处理方法之一。因此，本研究采用SPE进行样品前处理，采用UPLC-MS/MS方法检测目标化合物的残留。

本研究选用茶叶中常见、易检出的16种农药，建立TPT-SPE净化与UPLC-MS/MS相结合的方法，用于同时检测其在绿茶中残留，为茶叶中农药残留的快速检测提供可靠且有效的技术基础。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Waters ACQUITY UPLC H-Class 超高效液相色谱串联Xevo TQ-S micro三重四极杆串联质谱仪，配有MassLynx 4.1处理软件（美国Waters公司）；3K-15冷冻离心机（德国Sigma公司）；Vortex Genie 2型涡旋振荡器（美国Scientific Industries）；R-210旋转蒸发仪（德国IKA公司）；0.22 µm Filter Unit滤膜（天津博纳艾杰尔科技有限公司）。

农药标准物质：呋虫胺、氟啶虫酰胺、噻虫胺、噻虫啉、克百威、甲萘威、杀扑磷、啶氧菌酯、甲基异柳磷、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、唑虫酰胺、吡丙醚、氟虫脲、乙螨唑、醚菊酯（德国CNW Technologies Gmb H公司，纯度＞99.0%）。甲醇、乙腈（色谱纯，德国默克公司）；苯（分析纯，上海麦克林生化科技有限公司）；甲酸（色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司）；氯化钠（分析纯，广东光华科技股份有限公司）；超纯水（杭州娃哈哈有限公司）；Cleanert PestiCarb-SPE柱（填料量/上样体积：500 mg/6 mL）、Cleanert PSA-SPE柱（填料量/上样体积：1 g/6 mL）、Cleanert TPT-SPE柱（填料量/上样体积：1 g/6 mL）和Cleanert Florisil-SPE柱（填料量/上样体积：500 mg/3 mL）购自天津博纳艾杰尔科技有限公司。

1.2 标准溶液配制

混合标准品母液（10 mg·L-1）的配制：精准称取不同质量的农药标准物质于50 mL容量瓶中，并用乙腈进行溶解，定容，配制成浓度为100～500 mg·L-1的16种农药单标准品储备液。之后分别吸取不同体积的16种农药单标准品储备液于50 mL容量瓶中，用乙腈稀释混匀后定容至刻度线，放置在4℃冰箱中保存。

混合标准品工作液的配制：临用前，用乙腈对上述混合标准品母液（10 mg·L-1）进行稀释，配制成1.000、0.500、0.250、0.100、0.050、0.010、0.005 mg·L-1系列浓度的溶剂标准溶液。

茶叶基质匹配标准溶液的配制：绿茶空白样品经前处理后，在定容时加入系列混合标准品工作液，配制成1.000、0.500、0.250、0.100、0.050、0.010、0.005 mg·L-1系列浓度的基质匹配标准混合溶液。

1.3 样品的提取与净化

1.3.1 提取

准确称取5.00 g粉碎后的绿茶空白样品（精确至0.01 g）于50 mL带盖离心管中，加入10 mL水后混匀静置30 min，再加入20 mL 1%甲酸乙腈，涡旋振荡1 min，静置过夜后加入5.00 g氯化钠，涡旋振荡1 min，10 000 r·min-1离心5 min，然后取8 mL上清液于鸡心瓶中，旋转蒸发至接近干燥，再加入5 mL乙腈-苯

（乙腈∶苯=3∶1，下同）超声溶解，待净化。

1.3.2 净化

将TPT-SPE柱置于固相萃取装置上，用10 mL乙腈-苯预淋洗，弃去淋洗液。将鸡心瓶中溶液转移至TPT-SPE柱，接收流出液，继续加入25 mL乙腈-苯洗脱，合并接收流出液，旋转蒸发浓缩至近干后吹干，加入2 mL乙腈溶解残渣，过0.22 µm尼龙微孔滤膜后转移至进样小瓶，待UPLC-MS/MS进样分析。

1.4 添加回收率试验

在绿茶空白样品中，分别添加不同浓度的标准混合溶液，制备添加浓度水平为0.010、0.050、0.100 mg·kg-1和1.000 mg·kg-1的绿茶添加样品，每个添加水平3个重复，涡旋混匀后过夜放置，按照1.3章节进行提取净化后测定，以添加样品与基质标准样品中化合物的峰面积之比计算添加回收率，并获得相对标准偏差（RSD）。

1.5 检测条件

色谱条件：流动相A为0.1%甲酸-甲醇，流动相B为纯净水。流动相洗脱程序：0～1.5 min，5%～65% A；1.5～5.0 min，65%～85% A；5.0～7.5 min，85%～99% A；7.5～9.0 min，99%～100% A；9.0～9.8 min，100% A；9.8～10.3 min，100%～10% A。色谱柱：Acquity HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 µm）；柱温：40℃。进样量体积：5.0 µL；流速：0.25 mL·min-1。

质谱条件：电喷雾正电离模式ESI+，多反应监测MRM模式；离子源温度：150℃；脱溶剂N2气温度：350℃；流量：700 L·h-1；毛细管电压：3.5 kV；碰撞气Ar流量：0.35 mL·min-1；锥孔气N2流量：60 L·h-1；倍增电压：650 V。

1.6 数据统计与分析

回收率、标准曲线方程、基质效应等数据通过Excel 2019进行计算，使用OriginPro 2018进行作图。

2 结果与分析

2.1 仪器条件的优化

2.1.1 质谱条件优化

将16种目标化合物分别用乙腈配制成浓度为1.000 mg·L-1的溶液，用ESI+和ESI–模式进行全扫描，得出在ESI+模式下16种目标化合物响应较高。因此，16种目标化合物皆以[M+H]+为母离子进行二级质谱优化。优化最佳的锥孔电压，然后进行子离子扫描，每种化合物选择2个响应值最强的子离子作为定量离子和定性离子。最后在多反应监测（MRM）模式下，优化目标物离子碎片的最佳碰撞能量。最终在最佳条件下对16种目标农药进行检测，选择的质谱参数如表1所示。

2.1.2 色谱条件优化

在优化的质谱条件下，考察了不同流动相对目标农药质谱信号的影响。通常，在流动相中加入一定量的甲酸可以有效地增加目标化合物的离子化效率和优化峰形。因此，本研究通过执行1.5章节的梯度洗脱程序分别考察0.1%甲酸乙腈-水和0.1%甲酸甲醇-水作为流动相对16种目标化合物的分离效果。结果发现，0.1%甲酸乙腈-水作为流动相时目标化合物被更早的分离出来，当0.1%甲酸甲醇-水作为流动相时，虽然目标化合物的出峰时间有一定程度后移，但16种目标化合物离子响应、峰形及分离度更好。因此，最终确定采用0.1%甲酸甲醇-水作为本研究的流动相。

表1 16种农药的UPLC-MS/MS多反应监测参数

注：*指定量离子

Note: * represents quantification ions

2.2 样品前处理方法的优化

2.2.1 提取溶剂的优化

GB/T 23200.13—2016[24]中采用乙腈来提取茶叶中的农药残留。但是，本研究涉及的目标农药如克百威、甲萘威等显酸性，在提取溶剂中加入适量的酸，可一定程度增加目标农药在溶剂中的溶解度，从而提高提取效果[25-27]。此外，已有研究发现，对于氟啶虫酰胺、噻虫嗪和甲萘威等农药，甲酸-乙腈提取效果优于乙酸-乙腈[28-29]。因此，本研究对比了乙腈中含有不同比例（0%、1%、2%、5%）甲酸对农药的提取效果。结果如图1所示，采用含有1%甲酸的乙腈溶剂对添加水平为0.100 mg·kg-1绿茶空白样品进行提取，16种农药的回收率达到76.4%～106.5%，RSD为0.3%～17.2%；采用2%甲酸-乙腈进行提取，对呋虫胺和杀扑磷两种农药的提取效果比较差；同样，采用5%甲酸-乙腈进行提取，其对16种农药的综合提取效果略低于用1%甲酸-乙腈提取。而采用乙腈进行提取效果最差，大多数农药的回收率均未达到标准。因此选择含有1%甲酸的乙腈作为提取溶剂。

2.2.2 净化方式的优化

本研究比较了实验室常用的4种填料（PSA、GCB、Florisil、TPT）SPE柱对目标化合物回收率的情况。将0.50 mg·L-1的混合标准溶液，直接上样至不同的SPE柱进行净化，在相同的洗脱条件下，比较不同净化柱对目标化合物的洗脱效果。结果如图2所示，4种SPE柱中，TPT柱对这16种农药的净化效果最好，对目标农药的回收率达到了72.2%～103.7%，RSD为0.6%～5.5%。而PSA柱、GCB柱、Florisil柱均存在对一种或几种目标化合物洗脱困难的情况（如甲氨基阿维菌素B1a，甲氨基阿维菌素B1b）。这主要是因为Florisil柱和GCB柱对其吸附能力较强，难以洗脱，从而造成回收率较低[30]。因此，本研究选择TPT-SPE柱作为净化材料。

注：A：呋虫胺；B：氟啶虫酰胺；C：噻虫胺；D：噻虫啉；E：克百威；F：甲萘威；G：杀扑磷；H：啶氧菌酯；I：甲基异柳磷；J：甲氨基阿维菌素B1a；K：甲氨基阿维菌素B1b；L：唑虫酰胺；M：吡丙醚；N：氟虫脲；O：乙螨唑；P：醚菊酯。下同

图2 不同净化柱对农药回收率的影响

2.3 方法评价

2.3.1 方法的线性范围和基质效应

本研究的线性结果如表2所示，在0.005～1.000 mg·kg-1的浓度范围内，16种农药基质标准曲线线性关系良好，相关系数R在0.992 6～0.999 9，达到残留定量分析的要求。基质效应（Matrix effect，%）是指样品中的其他成分对分析测定产生的影响，主要是对分析物的浓度与测定准确度的影响，从而引起定量和定性的误差[31]。而由于茶叶基质的复杂性，则更有必要对茶叶中的基质效应进行评价。基质效应计算公式[32]如下：

Matrix effect=/×100%

其中为溶剂标准曲线的斜率，为基质标准曲线的斜率。通过计算得出16种农药在绿茶基质中的基质效应。结果如表2所示，目标农药分别在溶剂和茶叶基质中的线性关系良好。但是由于茶叶中含有色素、咖啡碱、糖类等多种复杂基质，在检测过程中会产生比较明显的基质效应。本研究中16种农药在检测过程中出现了较强的基质抑制效应。所以，为满足不同种类茶叶的检测要求，减轻或者消除基质效应产生的干扰，本研究采用基质匹配曲线校准进行定量分析[33-34]。

2.3.2 方法的准确度、精密度和定量限

绿茶基质中16种农药的添加回收率和精密度见表3。在0.010、0.050、0.100 mg·kg-1和1.000 mg·kg-14个添加水平下，目标化合物的回收率范围在74.0%～105.4%，RSD＜20.0%，该方法的回收率和精密度良好，符合农药残留检测对回收率和重现性的要求。本研究将回收率在70%～120%之间的最低添加浓度定义为方法的定量限（LOQ）。结果见表3，16种农药的定量限为10～50 μg·kg-1。

2.4 实际样品测定结果

本研究通过已建立的方法对实验室随机抽取的20份绿茶样品进行检测（样品于2021年5月—12月收集），其中有9份样品检出噻虫胺（0.010～0.049 mg·kg-1），6份样品检出氟虫脲（0.090～0.310 mg·kg-1），2份样品检出唑虫酰胺（0.065～0.078 mg·kg-1），1份样品检出吡丙醚（0.038 mg·kg-1），其余12种农药均未检出。其中检出农药的残留量均低于欧盟[9]和我国GB/T 2763—2021[10]中规定的最大残留限量。

表2 不同农药的线性方程和相关系数

表3 16种农药的添加回收率、相对标准偏差、检出限和定量限（n=3）

续表3

3 结论与讨论

本研究通过对样品提取净化、仪器条件进行优化，比较不同条件下对目标化合物回收率的影响，建立了1%甲酸乙腈进行提取，TPT-SPE柱净化与UPLC-MS/MS相结合的方法，成功用于同时检测绿茶中16种农药的残留。该方法重复性好，灵敏度高，目标农药在0.005～1.000 mg·kg-1范围内线性良好，相关系数R＞0.992 6。在0.010、0.050、0.100 mg·kg-1和1.000 mg·kg-1的添加水平下，农药的平均回收率在74.0%～105.4%，RSD＜20.0%，方法的定量限为10～50 μg·kg-1。此外，将建立的方法与国内外文献中报道的方法进行了比较，结果如表4所示。与其他方法相比，本方法涉及的农药更为广泛，除了茶叶中常用的几种农药外，还将GB/T 2763—2021在茶叶中新增加的农药如啶氧菌酯、杀扑磷以及甲基异柳磷加入到检测行列中，具有一定的先进性，大大增加了茶叶中农药残留检测的实用性。此外，GB/T 2763—2021中规定本研究的目标农药在茶叶中的检测总共需要4种不同的方法，与其相比，本研究的方法更简便，用一种方法便可同时检测16种目标化合物，并且定量限远远低于其规定的目标化合物在茶叶中的最大残留限量。本方法的灵敏度与其他文献中报道的单一农药检测或多农药检测方法相比，其定量限较低，显示出较高的灵敏度，满足了日常农药残留痕量检测的需求。

表4 本方法与其他已报道方法的对比

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Residue Determination of Sixteen Pesticides in Green Tea by UPLC-MS/MS

LI Ziqiang1,2, YANG Mei1*, ZHANG Xinzhong1*, LUO Fengjian1, ZHOU Li1, LOU Zhengyun1, SUN Hezhi1, WANG Xinru1, CHEN Zongmao1

1. Research Center of Quality Safety for Agricultural Products, Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences Hangzhou 310008, China; 2. College of Plant Protection, Jilin Agricultural University, Changchun 130000, China

An analytical method was developed for the simultaneous determination of 16 pesticide residues in green tea by ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS). The target pesticides in tea samples were extracted by acetonitrile with 1% formic acid, cleaned up by a TPT-SPE column, ionized in electrospray positive ionization source (ESI+) mode, and scanned for determination of the target parent and daughter ions by mass spectrometry in multiple reaction monitoring mode (MRM). The results show that the target pesticides were linear in the range of 0.005-1.000 mg·kg-1with the correlation coefficient2＞0.992 6. The average recoveries ranged from 74.0% to 105.4% at the four spiked levels of 0.010, 0.050, 0.100、1.000 mg·kg-1, and the relative standard deviations (RSD) were <20.0%. The limits of quantification were 10-50 μg·kg-1. The method is fast and sensitive, and the technical parameters are in accordance with the relevant domestic and international regulations and standards. And it can meet the requirements of simultaneous determination of various pesticide residues in green tea.

multi-residue of pesticides analysis, UPLC-MS/MS, TPT-SPE column clean, green tea

S571.1

A

1000-369X(2022)04-537-12

2021-11-02

2022-02-17

浙江省自然科学基金（LQ19B070007）、国家自然科学基金（42007354）

李自强，男，硕士研究生，主要从事农药快速检测研究。*通信作者：ymei2016@126.com，zxz.1982@163.com