优质轻简高效生产技术（八） 植物根际促生菌液态发酵菌剂的制备与蔬菜苗期应用技术

穆文强 尚庆茂 康慎敏 李平兰*

（1 中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083；2 中国农业科学院蔬菜花卉研究所，农业农村部园艺作物生物学与种质创制重点实验室，北京 100081）

植物根际促生菌是一类生活在植物根际，或附着于根系表面，或生活在植物体内的微生物，能够促进植物对矿质养分的吸收利用，抑制和拮抗病原菌生长，分泌植物生长激素，促进植物生长（穆文强 等，2022）。目前，国内已商品化的植物根际促生菌菌剂有液态发酵和固态发酵两种生产方式。液态发酵相比于固态发酵具有速度快、周期短、产量高、均匀性好、便于机械化操作、发酵过程易于控制、菌体可与培养基分离、菌量密度高等优点。笔者对植物根际促生菌菌剂液态发酵原料的选择、生产工艺、质量要求等进行介绍，并总结植物根际促生菌菌剂在蔬菜苗期的应用方法和效果，以期为植物根际促生菌菌剂的制备和应用提供参考。

1 原料选择

1.1 碳源 碳源是根际促生菌能正常生长与分裂的物质基础，也是构成根际促生菌发酵培养液的重要组成部分。常见的碳源有碳水化合物、脂肪、有机酸、醇类等，根际促生菌发酵多以碳水化合物作为碳源，常见的有葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉等（表1）。葡萄糖是最容易被利用的碳源，几乎所有的根际促生菌都可以直接利用，其作为发酵培养基的成分，是一种速效碳源，可以加速根际促生菌的生长。糖蜜是制糖工业的副产物，含有丰富的糖、无机盐和维生素等，营养丰富且价格低廉，是根际促生菌液态发酵的主要碳源之一。

1.2 氮源 氮源在根际促生菌发酵中主要用于合成细胞物质（氨基酸、蛋白质、核酸等）和含氮代谢产物，以促进菌体的生长。氮源可分为有机氮源和无机氮源两大类。液态发酵常用的可溶性有机氮源有花生饼粉、黄豆饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、蛋白胨等（表1）。有机氮源成分比较复杂，含有一些糖类、脂肪、无机盐、维生素以及某些生长因子，可以满足根际促生菌对多种营养物质的需求。常用的无机氮源有铵盐、硝酸盐和氨水等（表1）。无机氮源的吸收利用速度较快，消耗过快会使发酵体系的pH 发生改变，实际使用中要注意发酵罐pH 的变化，及时进行补料。

1.3 矿质元素 根际促生菌在生长、繁殖过程中需要磷、硫、镁、钾、钠、钙、铁、锰等无机盐和微量元素，在较低浓度下无机盐和微量元素对根际促生菌的生长具有促进作用，可以构成活性物质、调节生理活性和渗透压等（表1）。在芽孢杆菌液态发酵过程中，适量地添加硫酸镁、碳酸钙、氯化锰可以提高根际促生菌芽孢的形成率，有利于菌剂的储存。

表1 植物根际促生菌菌剂液态发酵所需的基本营养物质

1.4 代谢调节物质 在发酵过程中加入生长因子、代谢抑制剂、代谢促进剂、前体物质、辅因子等代谢调节物质，有助于调节根际促生菌的生长和产物的形成。

1.5 消泡剂 在发酵过程中，培养基成分的特点、根际促生菌自身的特性以及搅拌和供氧，会使发酵液产生大量泡沫，若泡沫得不到及时控制，易造成生产设备出现漫溢现象，进而影响生产过程控制和设备操作，以及产品质量，严重时会对设备造成腐蚀。常见的消泡剂种类有脂肪类、聚醚型、有机硅型、聚醚改性有机硅型（胡楠 等，2021）。

2 生产工艺

2.1 菌种选择 选择安全、适合生产、抗病、促生等性能优异的菌种，多菌株复合发酵时需要保证菌株的最适生长条件与培养参数相近，且菌株间无拮抗作用。

2.2 生产车间及环境要求 发酵车间与吸附等后处理车间保持一定的距离，相对隔离；发酵菌种的储藏间、无菌操作间与生产车间距离适当，防止储藏菌种被污染；发酵车间、控制车间等关键性生产车间，应采用双路供电或用一套发电机，防止因意外停电对生产造成损失；无菌操作间应配置更衣室区域，生产人员进入无菌操作间进行操作的流程：①进入操作间门并脱去外套，将个人衣物存放在衣柜内，填写无菌操作间进出登记表，在更衣室内脱去较厚的衣服，双手浸泡消毒，按照顺序戴好口罩，穿戴无菌工作服，戴好手套，方可进入清洁区域。② 工作完毕后，将废料、使用过的器皿等集中在一起，对内部环境进行打扫，操作员在退出无菌操作间之前，将垃圾推向缓冲间，然后去更衣室换回自己的衣服。③在无菌操作间内，工作人员不能同时开启两扇门进出，要做到随手关门；更衣室不能逆向进入；工作人员一旦进入污物区后，不得直接返回无菌操作间。离开无菌操作间时应打开紫外灯，每周用过氧乙酸、新洁尔灭等消毒剂对操作间地板进行消毒与清洗。

生产车间应保持整洁，在生产过程中采用蘸有过氧乙酸、新洁尔灭等消毒剂的抹布除去发酵罐外表的液体，保持发酵罐的清洁。厂区空气质量应符合GB 3095—1996《环境空气质量标准》中Ⅱ类标准要求，发酵用水应达到GB 3838—2002《地表水环境质量标准》中Ⅲ类标准要求，冷却水及其他用水等应符合GB 3838—2002《地表水环境质量标准》中Ⅳ类水质要求。

2.3 设备灭菌

2.3.1 高压灭菌 灭菌效果的好坏直接关系到发酵工艺是否能正常进行、产品是否合格，由于工业发酵设备的特点，普遍采用湿热蒸汽灭菌法。高温蒸汽使液体培养基、补料罐（包括培养基成分、酸、碱、消泡剂等）、管道、发酵设备温度上升到120℃左右，发酵罐压力维持在90～100 kPa（表压），并保持20～30 min（分）。液体培养基装料最大不超过发酵罐容积的80%。在对高温灭菌过程中会产生对菌体生长有害物质或易受高温破坏的物料进行灭菌时，应对该原料单独采用其他方式灭菌后进行混合，或适当降低灭菌温度和气压，同时延长灭菌时间。

2.3.2 空气质量要求 不同菌种由于生长速度快慢、发酵周期长短等差异，对空气质量要求不同；不同的生产车间对空气质量要求也不同，如控制区要求空气菌落数≤ 10 CFU·mL，洁净区要求空气菌落数≤ 1 CFU·mL，测定方法：9 cm 肉汤固体培养基平板露置30 min（分）后，37 ℃培养24 h（小时），观察培养基内菌落数。发酵过程中需要的无菌空气需满足NY/T 883—2004《农用微生物菌剂生产技术规程》中的要求。

2.4 发酵过程控制 植物根际促生菌菌剂液态发酵工艺流程如图1 所示。

图1 植物根际促生菌菌剂液态发酵工艺流程

2.4.1 接种量 种子发酵罐接种种子液的接种量应在0.5%～5.0%范围内；在多级发酵生产阶段，对于生长繁殖快的菌种〔世代时间＜ 3 h（小时）〕，从一级种子罐转向二级种子罐的接种量宜为5%～10%；对于生长繁殖较慢的菌种〔世代时间＞6 h（小时）〕，接种量不宜低于10%。

2.4.2 发酵温度 在发酵过程中可根据不同的目的产物、根际促生菌的生长和代谢特性，采用不同温度进行生产发酵，常见温度多为30～40 ℃。

2.4.3 供氧 根际促生菌多为好氧代谢菌株，在发酵过程中需保证培养基有足够的溶氧。根据发酵罐的特点，将供氧口设计在发酵罐底部，底部供氧可使氧气与液体培养基充分接触，与发酵罐的搅拌相配合，可最大限度地提高培养基中的溶氧量。

2.4.4 发酵终点判断 在发酵末期，根际促生菌的生长和代谢能力逐渐降低或停止，部分菌体开始衰老进入自溶阶段。下罐的时间对产品的质量有重要影响，在实际生产中，经济因素和质量因素是影响下罐时间的主要因素。可通过监测发酵液的酸碱度、溶氧量、透光率及黏度等理化参数作为判定发酵终点的依据；对于芽孢杆菌，可通过镜检观察菌体的形态、密度，要求芽孢杆菌发酵结束时芽孢形成率≥ 85%，便于后期储存。

2.5 后处理 后处理工艺大致分为两种方式：①发酵物直接分装或稀释后分装，形成液体产品；②发酵物与载体物料混合吸附，转化为固态、粉末状终端产品。

常见载体物料有草炭、泥炭、腐殖酸、黄腐酸、蛭石等，应满足NY/T 798—2015《复合微生物肥料》的规定，粪大肠菌数≤ 100 CFU·g；蛔虫卵死亡率≥ 95%；铬（Cr）≤ 150 mg·kg；铅（Pb）≤50 mg·kg；砷（As）≤ 15 mg·kg；镉（Cd）≤3 mg·kg；汞（Hg）≤ 2 mg·kg。

根际促生菌发酵液与吸附载体物料应混合均匀。混合时可添加一定量的保护剂或采取适当措施，以减少菌体的死亡。常见的保护剂有蔗糖、海藻糖、脱脂乳、可溶性淀粉等（Zhang et al.，2020；Nizar et al.，2022）。吸附和混合环节应注重无菌化操作，减少杂菌污染。

2.6 建立生产档案 每批产品的生产和检验结果都要有档案记载，内容包括产品的检验项目信息、检验结果、检验人信息、审定人信息、检验日期信息等。

2.7 产品质量跟踪 定期对产品质量进行检查，并建立产品申报档案，对产品申报情况进行跟踪。

3 质量要求

以每个发酵罐生产的菌液为1 个批次，进行产品抽样检测，并要求无菌操作。

3.1 菌量 要求菌液的有效活菌数≥ 2 × 10CFU·mL，霉菌杂菌数≤ 3 × 10CFU·mL，杂菌率≤ 10%。经过后处理形成粉末剂型的根际促生菌菌剂产品，要求有效活菌数≥ 2 × 10CFU·g，霉菌杂菌数≤ 3 × 10CFU·g，杂菌率≤ 20%，水分≤ 35%，细度≥ 80%。对于多菌株复合菌剂，要求每一种有效菌的含量≥ 1 × 10CFU·g（或CFU·mL）。

高活性、高数量的根际促生菌菌剂应符合NY/T 3083—2017《农用微生物浓缩制剂》要求，有效活菌数≥ 2 × 10CFU·g（或CFU·mL），杂菌率≤ 1.0%，霉菌杂菌数≤ 3 × 10CFU·g。

3.2 粪大肠菌群数 应符合GB 20287—2006《农用微生物菌剂》的规定，粪大肠菌数≤ 100 CFU·g（或CFU·mL）。

3.3 蛔虫卵死亡率 应符合GB 20287—2006《农用微生物菌剂》的规定，蛔虫卵死亡率≥ 95%。

3.4 重金属含量 应符合GB 20287—2006《农用微生物菌剂》的规定，铬及其化合物含量（以Cr计）≤150 mg·kg，铅及其化合物含量（以Pb计）≤ 100 mg·kg，砷及其化合物含量（以As计）≤ 70 mg·kg，镉及其化合物含量（以Cd计）≤ 10 mg·kg，汞及其化合物含量（以Hg计）≤ 5 mg·kg。

4 包装、标识、运输、储存和操作安全性

4.1 包装 液体菌剂的包装采用瓶或桶灌装，以mL 或L 为容积单位，经过吸附后的粉末菌剂采用袋装包装，以g 或kg 为质量单位，实际量不得低于包装标注量。

4.2 标识 包装袋上应印有植物根际促生菌种名称、活菌数、合格标识、商标、产品名称、生产厂家名称、地址、电话、产品质量（g 或kg）、生产日期、有效期、执行标准、生产批号、产品标准编号。

4.3 运输 运输途中要有遮挡物，防止雨淋、太阳暴晒及温度过高。严禁与其他有毒有害的物品混放或混在一起运输。装卸货时，要做到轻装轻卸，以免发生包装破损的情况。

4.4 储存 产品不能露天堆放，应存放于库房或仓库，保证储存环境阴凉（避光）、干燥、通风，防日晒雨淋，防35 ℃以上的高温长期暴晒，避免恶劣条件。

4.5 操作安全性 根际促生菌菌剂的生产应符合国家劳动安全、机械设备操作、用电、消防等相关法规，确保操作人员生命安全。

5 常用植物根际促生菌液态发酵菌剂

目前，我国已商品化、用于蔬菜的根际促生菌剂多为芽孢杆菌，还有少量霉菌，广泛用于黄瓜、番茄、辣椒、白菜等蔬菜生产（表2）。

表2 植物根际促生菌液态发酵制剂主要商品化产品

6 蔬菜苗期应用根际促生菌菌剂的方法和效果

6.1 应用方法 蔬菜苗期应用根际促生菌菌剂主要有3 种方法，即：种子处理、基质混拌、灌溉施入。

6.1.1 种子处理 该方法是将促生菌粘附在种子表皮，对粉剂菌剂较为适用，液体菌剂效果较差，要求含菌量为1 × 10～1 × 10CFU·mL。优点是很容易实现，不需要复杂的操作；根际促生菌可较好地定殖在种子附近，利用率最高。缺点是种子无法与杀虫剂、消毒剂等进行拌种，粘合剂会降低微生物的活性（John et al.，1988）。

6.1.2 基质混拌 该方法是在基质主原料混拌时加入根际促生菌菌剂，对粉剂菌剂和液体菌剂均适用，根际促生菌在育苗基质中的添加量宜为1 × 10～1 × 10CFU·mL，添加量过大会增加生产成本，降低内源性植物激素水平（杨会款，2020）。优点是应用场景较广、操作简单，基质工厂、育苗场均可完成菌剂与基质的混拌；根际促生菌作用时间长；采用穴盘育苗的蔬菜均适用。缺点是若根际促生菌在基质中混拌不均匀，易造成幼苗长势不一致。

6.1.3 灌溉施入 液体菌剂直接灌溉或稀释后灌溉，粉末菌剂需提前加入一定量水进行溶解，稀释后方可施用，含菌量多为1 × 10～1 × 10CFU ·mL。该方法的优点是操作简单，可在灌溉时加入根际促生菌，对蔬菜幼苗做到水分和菌剂的同时补充；可根据蔬菜幼苗长势和生长期长短，单次或多次灌溉施用。缺点是未用完的液体菌剂不易保存。

6.2 应用效果

6.2.1 促进蔬菜幼苗生长发育 贺字典等（2020）采用解磷圈法从15 株植物根际促生菌中筛选透明圈直径最大的解磷菌菌株LZT-5（不动杆菌）和FQG-5（嗜麦芽寡养单胞菌），采用育苗基质添加和灌根方式，测定解磷菌对幼苗期和成株期番茄促生作用及根围土壤养分的影响。结果表明，育苗基质中加入10%的FQG-5 和LZT-5 后，番茄幼苗株高、茎粗和叶面积显著高于其他处理；FQG-5 灌根后番茄根围的速效磷、速效钾、硝态氮、有机质、全氮、全磷、全钾含量均显著高于其他处理，表明解磷菌可以促进番茄根围土壤养分转化成速效性养分，从而促进番茄植株生长，提高产量。

梁建根等（2007）用CH1（短短芽孢杆菌）、CH2（枯草芽孢杆菌）3 × 10CFU·mL菌悬液浸泡黄瓜种子30 min（分），显著促进了黄瓜种子萌发和植株生长，减少了根系和叶片中活性氧和丙二醛积累。

6.2.2 增强非生物逆境抗性 郑娜等（2018）从盐碱地和重金属污染地筛选出的4 株菌株TM1109（）、KY5104（sp.）、TY4204（sp.）和KY4410（），在0.7%盐胁迫下对番茄鲜质量增长效果好，增长率为33%～50%。盐耐受机制研究结果显示：TY4204 和KY5104 通过诱导或增强SOD 和POD 活性来清除番茄体内氧自由基对番茄的损伤，也可以合成ACC 脱氨酶抗盐胁迫，同时通过降低叶片中MDA 含量来减轻番茄在盐胁迫下的损伤。TM1109 和KY4410 虽然不产生ACC 脱氨酶，IAA 产量水平也较低，但可以在盐胁迫下通过诱导或增强SOD 和POD 活性来清除番茄体内氧自由基对番茄的损伤，具备溶解有机磷的能力，且TM1109 可溶解无机磷并具备良好的生物膜形成能力，有助于番茄对营养的吸收和生物膜对离子的选择性吸收以抵抗盐胁迫。表明TM1109、KY5104、TY4204 和KY4410 菌株可以通过多种作用机制来缓解番茄盐胁迫并促进番茄生长。

6.2.3 防控病虫害 根际促生菌内生孢子的高抗性结构不仅能忍受恶劣环境，还可以通过分泌脂肽、抗生素、酶等物质来抑制植物病原体的生长。枯草芽孢杆菌SL-44 能激活辣椒幼苗抗青枯病的系统抗性，还能产生表面活性素、伊枯草菌素和丰原素等抗菌肽，抑制甚至破坏立枯丝核病菌菌丝的生长（Im et al.，2020）。王其传（2014）研究表明，接种1 ×10CFU·mLBBS 合剂的功能型生物活性基质，在西瓜、青花菜和辣椒等种苗培育过程中具有良好的促生和抗病效果，与常规育苗基质相比，促生效果分别达到63.13%、74.20%和35.27%，防病效果分别达到87.5%、83.1%和79.5%；在防治黄瓜根结线虫方面，用微生物功能型基质（接种AR l56-2生防菌剂，含菌量为1 × 10CFU·mL）培育黄瓜幼苗，定植后对根结线虫有明显的抑制作用。

康贻军等（2012）研究了RA2（）和WP8（）浸种和拌土处理对番茄青枯病的实际防治效果，以及对番茄根际微生物群落的影响。结果发现两个菌株都具有防治番茄青枯病的作用，并能不同程度地促进番茄幼苗生长，主要体现在其能够显著提高番茄幼苗健株率，用RA2 和WP8 浸种处理后的健株率分别达68.9%和62.8%，而病原菌（对照）处理的健株率仅为22.4%；可以促进幼苗地上部增高、增粗和根部生长，如WP8 浸种处理的茎叶干质量和根干质量分别达到4.87 mg·株和35.69 mg·株，分别比对照提高l10.82%和205.83%。浸种处理的促进效应明显优于拌土处理。