神农香菊茎叶总黄酮与总酚的提取纯化和抗氧化活性研究＊

冯 颖，李 彬，周春苗，叶利春，卢 山，刘义飞

（湖北中医药大学药学院 武汉 430065）

神农香菊（Chrysanthemum indicumvar.aromaticum）属于菊科菊属植物，是野菊的一个新变种[1]。神农香菊具有较高的药用价值，其干燥头状花序可入药,具有清热解毒、散风降压、平肝明目等药理作用；从神农香菊中提取的精油具有较强的抑菌，可以作为食品中一种天然抗氧化剂[2]。然而，神农香菊的利用多集中在花部位，其茎和叶则在收获期间被丢弃，导致资源的巨大浪费。因此，为了实现神农香菊资源利用的最大化，急需对其茎叶的潜在价值进行深入研究和评估。

目前，针对神农香菊的次生代谢产物，大多数研究集中在对其挥发性物质成分的分析，只有少量研究关注到其黄酮类化合物的含量，极少从分子层面对神农香菊黄酮与酚酸类进行成分鉴定[3-4]。因此，本文首先筛选适宜于从神农香菊茎叶中提取纯化总黄酮与总酚的工艺参数，然后使用超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱（UPLC-MS/MS），通过多反应监测（MRM）模式建立一种能够同时测定神农香菊茎叶提取物中多种成分的定性和定量分析方法，最后通过DPPH 自由基清除试验和分子对接评价神农香菊茎叶提取物作为天然抗氧化原料的潜力，为神农香菊茎叶资源的应用提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

本实验所使用的仪器主要包括UV-1800PC 紫外可见分光光度计（上海翱艺仪器有限公司），RE52-99旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂），SCQ-5201C 超声波清洗器（上海声彦超声波仪器有限公司），Scientz-100F 冷冻干燥机（宁波新芝生物科技股份有限公司），Nexera X2 超高效液相色谱仪（日本岛津）和4500 QTRAP串联质谱（美国应用生物系统公司）等。

1.2 原料与试剂

神农香菊茎叶原料采集于湖北神农架中医药产业研究院神农香菊种植基地。新鲜茎叶用纯化水洗净晾干，液氮速冻后通过研磨机碾碎，在铝箔包裹下于-80°C 冰箱内保存备用。大孔树脂（AB-8、D101、HP-20）购自东鸿化工有限公司；色谱级甲醇、乙腈购自默克公司；分析级无水乙醇、盐酸、氢氧化钠等购自国药集团化学试剂有限公司；儿茶酚、芦丁、槲皮素、蒙花苷、绿原酸、去甲汉黄芩素、木犀草素、芹菜素、3-羟基黄酮和1,1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）购自上海源叶生物科技有限公司；二丁基羟基甲苯（BHT）购自江西阿尔法高科药业有限公司。

2 方法与结果

2.1 总黄酮与总酚的标准曲线绘制

总黄酮含量（TFC）测定采用Wang等[5]描述的方法进行。取适量芦丁溶液于25 mL 容量瓶中，加入1 mL亚硝酸钠溶液（10%）混匀，放置6 min；然后加入1 mL硝酸铝溶液（5%）混匀，放置6 min；最后加入5 mL 氢氧化钠溶液（4%），用60%乙醇溶液定容至刻度混匀，放置15 min 后，使用紫外-可见分光光度计在510 nm处测量吸光度。以吸光度为纵坐标，质量浓度为横坐标，进行线性回归，得标准曲线方程y=11.7x+0.0054（r2=0.9990）。

总酚含量（TPC）测定采用Yoshimoto 等[6]描述的方法进行。取0.1 mL 儿茶酚溶液与0.5 mL 福林-酚试剂涡旋混匀，在 25°C 下放置 20 min；再加入 0.5 mL 碳酸钠溶液（6%）和0.9 mL 双蒸水，涡旋混匀，放置10 min后，使用紫外-可见分光光度计在760 nm 处测量吸光度。以吸光度为纵坐标，质量浓度为横坐标，进行线性回归，得标准曲线方程y=0.0093x+0.0005（r2=0.9997）。

2.2 神农香菊茎叶总黄酮与总酚的提取

2.2.1 单因素考察

神农香菊茎叶总黄酮和总酚的提取使用超声波辅助进行（温度为25°C，频率为50 Hz）[7]，工艺流程如图1A 所示。首先称取神农香菊茎叶原料5 g，反复提取两次，过滤并合并滤液；然后将粗提液在50°C 下减压蒸发浓缩；最后冷冻干燥以完全去除水分。单因素试验分别按照以下条件进行：料液比（1:5 g·mL-1、1:10 g·mL-1、1:20 g·mL-1、1:30 g·mL-1、1:40 g·mL-1、1:50 g·mL-1）、乙醇浓度（30%、40%、50%、60%、70%、100%）、提取时间（20 min、40 min、60 min、80 min、100 min、120 min）。结果如图1B-D 所示，在料液比为1:5 g·mL-1、乙醇浓度为70%和提取时间为40 min时，总黄酮和总酚的提取率最高。

图1 神农香菊茎叶的提取流程和单因子考察

2.2.2 正交试验

在单因素考察基础上，采用L（933）正交试验设计进一步优化了神农香菊茎叶总黄酮和总酚的提取参数[8]。如表1 所示，分别选取了料液比、乙醇浓度和提取时间三个因素中的三个较优水平进行优化。每份试验重复测定三次，结果表示为平均值±标准差。结果如表2，三个因素对总黄酮提取率的影响顺序为料液比（R=5.30）＞乙醇浓度（R=5.01）＞提取时间（R=1.92）。类似的，三个因素对总酚提取率的影响顺序也为料液比（R=1.62）＞乙醇浓度（R=1.43）＞提取时间（R=0.34）。该结果与方差分析中的F 值大小是一致的（表3）。因此，确定神农香菊茎叶总黄酮和总酚的最佳提取参数如下：乙醇浓度70%，料液比1:5 g·mL-1，提取时间60 min。该最佳参数组合包括在9 组试验中（A2B1C2），且表现出最高的总黄酮提取率（18.30%）和总酚提取率（6.01%）。

表1 正交试验设计中使用的因素和水平

表2 神农香菊茎叶总黄酮和总酚提取率的正交试验设计和结果（n=3）

表3 正交试验的方差分析

2.3 神农香菊茎叶总黄酮与总酚的纯化

2.3.1 大孔树脂的预处理

本文考察了常用于黄酮纯化的三种树脂类型（AB-8、D101 和 HP-20）。首先树脂以 1:20（树脂/溶剂）的比例在95%乙醇溶液中浸泡24 h，充分溶胀后用去离子水洗涤树脂至无乙醇味，再依次在5%氢氧化钠（m/v）和5%盐酸（v/v）溶液中浸泡24 h；然后将树脂用去离子水洗涤，直至达到中性。最后将树脂浸泡在无水乙醇中，再次用水洗涤至无乙醇味[9]。

2.3.2 大孔树脂的筛选

称取处理后的三种树脂各4 g于100 mL具塞锥形瓶中，加入30 mL 样品溶液，置恒温振荡器中振摇24 h使总黄酮和总酚充分吸附（25°C，100 rpm），离心，过滤并测定滤液中总黄酮和总酚含量。然后用去离子水洗涤树脂两次，再将洗涤后的树脂置于40 mL 的60%乙醇溶液中振摇24 h 使总黄酮和总酚充分解吸附，离心，过滤并测定滤液中总黄酮和总酚含量。以树脂的静态吸附率（A%）和静态解吸率（D%)为指标，每份样品重复三次。

结果如图2 所示，D101 树脂对总黄酮的吸附率最高，HP-20 树脂对总酚的吸附率最高。另一方面，D101树脂对总黄酮和总酚都具有最优的解吸附能力，而HP-20 树脂对总酚的解吸率明显偏低，表明总酚不能充分从HP-20树脂中洗脱。相比之下，D101树脂更适合富集纯化神农香菊茎叶总黄酮与总酚。

图2 三种大孔树脂的吸附率和解吸率

2.3.3 上样浓度的影响

动态吸附和解吸附过程采用填充D101 树脂（干重为9.82 g）的玻璃层析柱（2.6 cm×30 cm）进行，柱体积为40 mL（1 BV）。分别向层析柱中加入120 mL 不同浓 度（0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15 和 0.16 g·mL-1）的样品溶液，控制上样流速为3.0 BV/h，收集流出液，测定吸光度并计算不同浓度下总黄酮和总酚的吸附率。结果如图3A 所示，在考察范围内总黄酮和总酚的吸附率呈现出先上升后下降的趋势。当上样浓度为0.12 g·mL-1时，总黄酮和总酚的吸附率达到其最大值，分别为94.48%和87.69%。因此，选择上样浓度为0.12 g·mL-1进行后续试验。

2.3.4 上样体积的影响

制备浓度为0.12 g·mL-1的神农香菊茎叶提取液（总黄酮含量为 3241.90 ± 3.61 μg·mL-1、总酚含量为892.78 ± 0.20 μg·mL-1），以 3.0 BV/h 的流速加入到D101 树脂层析柱中，每1 BV 收集1 份流出液，测定吸光度并计算不同体积下总黄酮和总酚的含量。当流出液中总黄酮或总酚的含量达到初始样品溶液的10%时，即达到泄露点。从图3B 可以看出，当上样体积为3 BV时，流出液中总黄酮与总酚的浓度刚好达到初始样品浓度的10%，分别为344.70 μg·mL-1和88.72 μg·mL-1，表明树脂已达到动态吸附平衡。因此，选择上柱体积为3 BV。

2.3.5 上样流速的影响

将120 mL 浓度为0.12 g·mL-1的神农香菊茎叶提取液，以不同流速（1.5、3.0、4.5、6.0和7.5 BV/h）加入到D101树脂层析柱中进行动态吸附。收集流出液，测定吸光度并计算不同流速下总黄酮和总酚的吸附率。如图3C 所示，当上样流速大于3.0 BV/h 时，总黄酮与总酚在树脂上的吸附率显著降低。这可能是因为流速较大时，样品溶液与树脂的接触时间较短，黄酮和多酚类化合物不能及时被吸附而发生泄漏。考虑到时间成本，选择最佳纯化流速为3.0 BV/h。

2.3.6 洗脱浓度的影响

首先按照上述优化后的吸附条件进行吸附过程，待上样完毕后静置30 min，使用120 mL 去离子水洗涤树脂两次去除杂质。然后，以120 mL 不同浓度（10%、30%、50%、70%、80%和90%）的乙醇溶液进行洗脱，流速为3 BV/h。收集洗脱液，测定吸光度并计算不同乙醇浓度洗脱下总黄酮和总酚的解吸率。结果如图3D 所示，当乙醇浓度为80%时，总黄酮和总酚的解吸率同时达到最大值；当乙醇浓度继续增加时，两者解吸率呈下降趋势。因此，选择80%乙醇溶液作为解吸附溶剂。

2.3.7 洗脱流速的影响

使用相同的程序，将120 mL 80%乙醇溶液以不同流速（1.5、3.0、4.5、6.0 和7.5 BV/h）加入到层析柱中进行洗脱。收集洗脱液，测定吸光度并计算不同洗脱流速下总黄酮和总酚的解吸率。从图3E可以看出，当洗脱流速大于4.5 BV/h 后，总黄酮与总酚的解吸率均显著降低，表明低流速更有利于总黄酮与总酚的洗脱，这可能是由于乙醇能充分进入树脂孔径内部使黄酮和多酚洗脱。考虑到时间成本，选择洗脱流速为4.5 BV/h。

图3 动态吸附和解吸附曲线

2.3.8 洗脱体积的影响

使用相同的程序，将120 mL 80%乙醇溶液以4.5 BV/h的流速进行洗脱。每1 BV 收集1份洗脱液，测定吸光度并计算不同洗脱体积下总黄酮和总酚的解吸率。结果如图3F 所示，洗脱峰主要集中在0-3 BV 的洗脱体积内，表明大部分总黄酮和总酚已被解吸附[10]。相比总酚而言，总黄酮的峰窄而高，说明总黄酮比总酚更容易从树脂中洗脱出来。当洗脱体积大于4 BV时，洗脱液中总黄酮的含量基本未发生变化，表明树脂中所吸附的黄酮已洗脱完全；而在5 BV的洗脱体积下，洗脱液中的总酚才基本洗脱完全。考虑到在4 和5 BV 时，洗脱液中总酚含量的差异小于2%，洗脱体积的增加可能会导致成本和所需时间增加，也不利于溶液的浓缩，因此确定洗脱体积为4 BV。

2.3.9 纯化工艺验证

使用D101 大孔树脂对神农香菊茎叶粗提液进行动态吸附和解吸附，上样浓度为0.12 g·mL-1，上样体积为3 BV，上样流速为3.0 BV/h，洗脱溶剂为80%乙醇溶液，洗脱流速为4.5 BV/h，洗脱体积为4 BV。以纯化率作为验证指标，进行三批验证试验。结果表明，经过D101 大孔树脂吸附后，提取物中总黄酮纯度为52.18±0.52%，总酚纯度为24.24±0.54%，分别是粗提物的2.85倍和4.03倍。

2.4 神农香菊茎叶提取物纯化前后的UPLC-MS/MS分析

2.4.1 色谱条件

Agilent SB-C18 色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流动相A为超纯水（加入0.1%的甲酸），B为乙腈（加入0.1%的甲酸），梯度洗脱程序：0.0-5.0 min，18%B；5.0-15.0 min，25% B；15.0-20.0 min，25% B；20.0-30.0 min，25% B；30.0-45.0 min，33% B。流速为0.35 mL·min-1，柱温为40°C，进样量为4 μL。

2.4.2 质谱条件

电喷雾离子源（ESI），离子喷雾电压（Ion Spray Voltage）5500 V（正离子模式）；多反应检测模式（MRM）；离子源气体I（GS I）,气体Ⅱ（GSⅡ）和帘气（CUR）分别设置为 50、60 和 25 psi；离子源温度为550°C。各标准品的优化质谱离子参数见表4。

表4 被测样品离子优化参数。

2.4.3 样品溶液的制备

分别称取0.01 g 纯化前后的样品，加入20 mL 80%甲醇超声溶解，离心，取上清液用0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.4.4 混合标准品溶液的制备

分别称取适量芦丁、芹菜素、去甲汉黄芩素、蒙花苷、槲皮素、木犀草素、3-羟基黄酮和绿原酸对照品，加入80%甲醇超声溶解，制成浓度为1.0 mg ·mL-1的单一标准品储备液；然后分别量取适量各标准品储备液，逐级稀释配制成不同浓度的混合标准品储备液。

2.4.5 系统适应性试验

吸取适量供试品稀释液和混合标准品溶液，按以上色谱和质谱条件进样测定。总离子流图如图4 所示，8 个成分之间分离良好，分离度均大于1.5，并以蒙花苷为例给出其MRM 扫描下的色谱图信息，样品稀释液与混合对照品的质谱图各成分离子流色谱峰保留时间相对应，表明本方法专属性良好。

图4 神农香菊样品UPLC-MS/MS色谱图

2.4.6 线性关系考察

吸取适量混合标准品溶液，加80%甲醇稀释为5-500 μg·L-1的梯度溶液。以待测物的峰面积对其相应的质量浓度做线性回归分析，计算各相关系数，结果均大于0.998，表明8 种标准品在该范围内线性关系良好。以信噪比（S/N ≥10）为定量限（LOQ），信噪比（S/N ≥ 3）为检测限（LOD）（表5）。

表5 八种成分的线性回归方程、线性范围、相关系数、检测限和定量限（n=6）。

2.4.7 精密度试验

吸取适量混合对照品溶液，一天内连续进样6次，记录各标准品的峰面积。经计算，芦丁、芹菜素、去甲汉黄芩素、蒙花苷、槲皮素、木犀草素、3-羟基黄酮和绿原酸的RSD 值分别为0.86%、0.96%、1.14%、0.81%、0.85%、1.07%、1.24%和0.98%，表明仪器精密度良好。

2.4.8 重复性试验

称取上述纯化后的冻干粉共6份，制备样品溶液，按上述条件进行检测，记录各个化合物的峰面积。经计算，芦丁、芹菜素、去甲汉黄芩素、蒙花苷、槲皮素、木犀草素、3-羟基黄酮和绿原酸的RSD 值分别为0.8%、1.2%、1.0%、1.5%、1.2%、2.2%、2.2%、2.6%，表明仪器重复性良好。

2.4.9 稳定性试验

将上述样品溶液于室温下放置0、2、4、6、8、10 和12 h，进样测定，记录各个化合物峰面积。经计算，芦丁、芹菜素、去甲汉黄芩素、蒙花苷、槲皮素、木犀草素、3-羟基黄酮和绿原酸的RSD 值分别为1.3%、0.3%、0.7%、1.0%、2.0%、1.3%、2.5%、2.0%，表明样品稳定性良好。

2.4.10 加标回收率试验

称取8 份已知含量的纯化后冻干粉样品，每份约0.05 g，然后分别加入相当于样品中各标准品量80%、100%和120%的对照品，每个水平平行三次，记录峰面积并计算加样回收率。结果表明，芦丁、芹菜素、去甲汉黄芩素、蒙花苷、槲皮素、木犀草素、3-羟基黄酮和绿原酸的平均加标回收率分别为101.68%、99.67%、101.34%、100.51%、98.94%、97.67%、96.51% 和99.63%，其 RSD 值 分 别 为 0.89%、2.23%、0.97%、1.26%、1.41%、1.12%、1.27%和 0.89%，表明该方法准确度良好。

2.4.11 含量测定

称取适量纯化前后的神农香菊茎叶提取物，按照上述检测条件进行测定，根据标准曲线计算其含量（表6）。选取绿原酸与蒙花苷为《中华人民共和国药典》2020 版“菊花”和“野菊”项下规定的检测指标，其他检测成分为目前神农香菊与野菊相关文献报导的主要成分[11]。为确定8 种物质在神农香菊提取物中的存在确定性与含量，因此采用超高效液相色谱串联三重四极杆质谱对成分进行定性定量分析。与纯化前相比，纯化后提取物中芦丁、芹菜素、去甲汉黄芩素、蒙花苷、槲皮素、木犀草素、3-羟基黄酮和绿原酸等8种物质的含量都显著增加，这可能表明大孔树脂的应用有利于黄酮类和酚类物质的富集，因此导致纯化后提取物中总黄酮和总酚含量增加。

表6 纯化前后神农香菊茎叶提取物中8种成分的含量（n=3）。

2.5 DPPH自由基清除试验

本文采用DPPH 自由基清除方法评价了神农香菊茎叶提取物的抗氧化能力，以BHT 为阳性对照，因为其作为一种最常用的抗氧化剂，普遍应用于食品、化妆品和药品中。根据Andrade 等[12]描述的方法，称取适量纯化后的样品粉末，用无水乙醇溶解并稀释成一系列浓度为0.02-0.4 mg·mL-1的样品溶液。然后取1 mL 样品溶液与3 mL DPPH 乙醇溶液（0.2 mM）涡旋混匀，置25°C 黑暗环境下反应30 min，使用紫外-可见分光光度计在517 nm处测量吸光度。DPPH自由基清除率（SR）计算为：

其中，A1为 DPPH 的吸光度，A2为 DPPH 与样品溶液的吸光度，A3为样品溶液的吸光度。半数抑制率（IC50）根据DPPH 自由基清除率对样品浓度的曲线计算。每份试验重复进行三次。

如图 5 所示，当样品浓度为 0.2 mg·mL-1时，DPPH自由基清除率已达到88.26%，表明神农香菊茎叶提取物对DPPH 自由基具有较好的清除活性。经计算，神农香菊茎叶提取物和BHT的IC50分别为0.086 mg·mL-1和0.056 mg·mL-1，表明BHT 的半数清除活性更低。然而，可以观察到当浓度大于0.15 mg·mL-1时，在相同浓度下，神农香菊茎叶提取物的DPPH 自由基清除率相比BHT 而言更大。总的来说，神农香菊茎叶提取物具有良好的抗氧化效果，可以作为天然抗氧化剂的潜在来源。

图5 0.02-0.4 mg·mL-1浓度范围内的DPPH自由基清除率图

2.6 分子对接

据报道，木犀草素、槲皮素和芹菜素等黄酮类化合物可以作为一种潜在的黄嘌呤氧化酶抑制剂，对体内黄嘌呤氧化过程中超氧阴离子(O2-)或过氧化氢的产生具有较强抑制作用[13-15]。因此，通过分子对接技术进一步探索了神农香菊茎叶提取物中去甲汉黄芩素和3-羟基黄酮的体内抗氧化潜力。配体的SDF 结构文件来源于PubChem 数据库，黄嘌呤氧化酶的晶体结构来自于RCSB 蛋白数据库（PDB ID:3ETR）。通过去除所有水分子，加入氢原子以及计算Gasteiger 电荷制备了受体蛋白的坐标文件。随后，使用AutoDock 4.2进行了分子对接，网格尺寸设置为 126 Å × 126 Å ×126 Å，网格间距设置为0.375 Å。对接计算采用拉马克遗传算法（LGA）作为搜索参数，其它参数设置为默认值。基于能量的评分函数包括了范德华力、静电相互作用、氢键和熵效应，以结合能最低的构象表示小分子配体-蛋白最可能的结合模式。

如图6A所示，去甲汉黄芩素的A环羟基上氧原子分别与黄嘌呤氧化酶中缬氨酸（VAL259）、甘氨酸（GLY260）、天冬酰胺（ASN261）、苏氨酸（THR262）和谷氨酸（GLU263）残基上的氢原子形成了氢键相互作用，其结合能为-8.7 kcal·mol-1。如图6B 所示，3-羟基黄酮C环羟基上氧原子分别与黄嘌呤氧化酶中丝氨酸（SER347）和甘氨酸（GLY350）残基上的氢原子形成了氢键相互作用，其结合能为-8.4 kcal·mol-1。两种分子的结合位点主要位于FAD 域周围，这与槲皮素和黄嘌呤氧化酶结合的活性位点相似，表明去甲汉黄芩素和3-羟基黄酮与黄嘌呤氧化酶具有较强的结合能力[12]。

图6 分子对接示意图

3 讨论

首先考察了料液比、乙醇浓度和提取时间对总黄酮和总酚提取率的综合影响，筛选出最佳提取工艺。然后，为了进一步提高提取物中总黄酮和总酚的含量，对纯化工艺进行了筛选。大孔树脂吸附技术因其成本低、安全性好、易于回收和环境污染小等特点，被选择用于黄酮和酚类物质的分离纯化[16]。与纯化前相比，纯化后的提取物中总黄酮和总酚纯度分别为提高了2.85 倍和4.03 倍。通过UPLC-MS/MS 分析表明，芹菜素、去甲汉黄芩素、槲皮素、木犀草素和绿原酸等的含量显著增加。因此，本研究筛选的纯化工艺可应用于改善神农香菊茎叶总黄酮和总酚的纯度。

与常用抗氧化剂BHT 相比，神农香菊茎叶提取物具有较强的自由基清除活性，这可能与其中的黄酮和酚酸类化合物有关。根据文献报道[17-18]，黄嘌呤氧化酶是人体氧源自由基的重要生物学来源，它参与了许多对组织氧化损伤的过程，包括炎症、衰老和痛风等，而黄酮类化合物可以作为黄嘌呤氧化酶的一种潜在抑制剂，发挥抗氧化作用。分子对接作为一种常用的辅助工具，被使用进一步探索神农香菊茎叶中黄酮分子与黄嘌呤氧化酶的结合机制。总之，本研究为神农香菊茎叶资源的可回收利用提供了一种有前景的策略。